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2.2 动物细胞工程（第1课时）
动物细胞工程的发展历程
1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。
1951年，张明觉等发现了哺乳动物精子获能现象。
1959年，试管家兔诞生。之后，多种试管动物相继出生。
1958年，格登用非洲爪蟾进行体细胞核实验，同期，我国科学家童第周开展了鱼类细胞核移植工作。
1975年，米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术。
1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊
1981年，埃文斯等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞
2006年，山中伸弥等获得了诱导多能干细胞。我国科学家用这种细胞培育了小鼠。
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。
2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
照片中两只可爱的小孩，分别叫“中中”和“华华”，它们于2017年诞生于中国，是世界首例体细胞克隆猴，轰动全世界！
本节聚焦
动物细胞培养需要哪些基本条件
动物细胞培养的基本操作过程是什么
怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险
皮肤的自体移植
灰绿色
小面积烧伤：植皮(自身)后恢复
1）使用他人皮肤？
患者自身的不够用，如何解决？
大面积烧伤？
2）培养自身细胞？
从社会中来
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
通过细胞培养构建人造皮肤
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；
一、动物细胞培养
培育的终点：细胞
1.概念：
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
2.目的：
获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。
3.原理：
细胞增殖（有丝分裂）
那么，动物细胞的培养需要哪些条件呢？
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
动物细胞培养的条件
营养物质
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
1.动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等
合成培养基
（将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配置而成的培养基）
液体培养基
（培养液）
含有多种未知的促细胞生长因子及其他活性物质，可以补充合成培养基中缺乏的物质
1.动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
(1)营养
(2)无菌、无毒的环境
无菌
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液，以便清除代谢物
无毒
超净工作台
1.动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
(3)适宜的温度、pH和渗透压
哺乳动物多以（36.5±0.5）℃
温度：
pH：
多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4
渗透压：
需要考虑的一个重要环境参数
O2:
细胞代谢所必需的
CO2：
维持培养液的pH
（95%空气和5% CO2 ）
CO2 培养箱
微生物培养中的作用不同（为自养型微生物提供碳源）
1.动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
(4)气体环境
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2培养箱中培养
细胞贴壁
接触抑制
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
2.动物细胞培养的过程
动物组织块
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
问题
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
接触抑制
解决
传代培养
分瓶
一、动物细胞培养
思考：1、选动物幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料的原因？
因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
思考：2、用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理组织块，使组织块分散成单个细胞的目的是什么？
①使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需的O2和营养物质的供应，另一方面保证细胞内代谢废物的及时排出；
②使得在细胞水平操作的其它技术得以实现。
思考：3、用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？
思考：4、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？
主要是蛋白质(胶原蛋白等)。
能，应注意时间的控制。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间还会分解膜蛋白，对细胞造成损伤。
思考：5、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？
不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
（1）细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。
（2）培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。
培养皿
培养瓶
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
瓶壁上的细胞层数是：一层（或单层）
贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
（3）接触抑制
分瓶培养
解除方法
癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
（5）传代培养:
（4）原代培养:
在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
思考：6、用胰蛋白酶两次处理的目的是？
第一次处理的目的是使组织细胞分散开；
第二次处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分瓶后继续培养。
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
取动物组织
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
细胞悬液
原代培养
分瓶
培养
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
加培养液
在培养皿或培养瓶内
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
一、动物细胞培养
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，増殖能力越强，所以更容易培养。
思考 讨论
一、动物细胞培养
2. 动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？
培养结果
动物血清
植物激素
常用液体培养基
常用固体培养基
培养基性质
细胞的全能性
原 理
动物细胞培养
植物组织培养
比较项目
新的细胞群，不形成个体
完整植株
培养基特有成分
细胞增殖
思考 讨论
一、动物细胞培养
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基
培养基特有成分
过程
结果
相同点 固体培养基
葡萄糖、动物血清
液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
许多细胞
蔗糖、植物激素
①都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
新的植株
外植体
↓脱分化
愈伤组织
　 ↓再分化
芽、根或胚状体
↓生长发育
植物体
动物的组织
　　　　　 ↓ 机械法或胰蛋白酶、
↓ 胶原蛋白酶处理
细胞悬液
↓
原代培养
↓
细胞悬液
↓
传代培养
小结
(1)动物细胞培养体现了动物细胞的全能性(　　)
(2)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞(　　)
(3)悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集(　　)
(4)动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH(　　)
×
√
1.判断正误
×
√
即时训练
2.一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件
①无毒的环境　②无菌的环境　③只使用合成培养基　④温度与动物的体温相近　⑤因在CO2培养箱中培养，故不需要O2　⑥多数动物细胞培养在7.2～7.4的pH环境
A.①②④⑤⑥ B.①②③④
C.①②③⑤⑥ D.①②④⑥
√
即时训练
3.在将动物组织块分散成单个细胞时，可以使用胰蛋白酶。由此判断以下推测不合理的是
A.动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系
B.处理时一定要注意处理时间、加酶量
C.胰蛋白酶一定不会对动物细胞造成损伤
D.动物细胞培养液的pH应与胰蛋白酶作用的适宜pH基本一致
√
即时训练
学而时习之

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