资源简介

发酵工程
复习课
第一章
第一步：单元思维导图回顾知识
第二步：课前小热身
1．传统发酵利用的菌种是人工保留的菌种。 ( )
2．泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件。 ( )
3．酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵温度。 ( )
4．醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生乙酸。 ( )
5．在制作果酒、果醋时，适当加大接种量可以提高发酵速率、抑制杂菌生长繁殖。 ( )
6．在发酵工程中，可通过诱变育种、基因工程育种获得菌种。 ( )
7．分离、提纯酵母菌发酵生产的单细胞蛋白，可采用过滤、沉淀等方法。 ( )
8．在连续培养过程中补充的同种培养液和空气须先灭菌。 ( )
×
×
×
×
√
√
√
√
是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品，它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。
1.发酵工程的概念：
一、发酵与传统发酵技术
2.发酵概念：
3.发酵原理
发酵是指人们利用_______，在_____的条件下，将原料通过
___________转化为人类所需要的产物的过程。
微生物
适宜
微生物的代谢
_________________________________，因此利用它们就可以生产
出人们所需要的多种产物。
不同的微生物具有产生不同代谢产物的能力
4.发酵类型
a.好氧发酵
b.厌氧发酵
醋酸发酵
酒精发酵、乳酸发酵
5.传统发酵技术的概念
直接利用原材料中________ 的微生物，或利用_____ ____保存下来的
面团、卤汁等__ ____中的微生物进行发酵、制作食品的技术。
天然存在
前一次发酵
发酵物
6.传统发酵技术的特点
传统发酵以混合菌种的_____ ___及_________为主，通常是_______
或_______的。
固体发酵
半固体发酵
家庭式
作坊式
7.传统发酵技术常见产品
腐乳、酱、酱油、醋、泡菜、豆豉
项目
菌种
生物类群
代谢类型
菌种来源
腐乳制作
主要为毛霉
真核生物
异养需氧型
主要是空气中的毛霉孢子
泡菜制作
乳酸菌
原核生物
异养厌氧型
主要是附着在蔬菜上的乳酸菌
果酒制作
酵母菌
真核生物
异养兼性厌氧型
主要是附着在葡萄皮上的酵母菌
果醋制作
醋酸菌
原核生物
异养需氧型
空气中的醋酸菌或人工接种
8.传统发酵常见菌种
二、尝试制作传统发酵食品
（一）制作腐乳
1.参与发酵的微生物：
多种微生物，如_____、_____和___________等；
2.发酵原理
毛霉等微生物能产生______和_____等；
经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解为___________________。
（*此外，微生物还可以产生脂肪酶，将脂肪分解为脂肪酸和甘油）
酵母
曲霉
毛霉（主要）
蛋白酶
肽酶
小分子的肽和氨基酸
3.制作流程
让豆腐长出毛霉
直接利用空气中的毛霉孢子或者直接接种毛霉
目的：让毛霉等产生蛋白酶和肽酶
加盐腌制
目的：析出豆腐中的水分、抑制不需要的微生物生长
加卤汤装瓶
卤汤包括酒和香辛料
酒：抑制微生物生长，并使腐乳具有独特香味；
香辛料：调味，防腐杀菌
密封腌制
*卤汤中酒的含量应控制在12%左右，过高会延长腐乳成熟的时间，过低不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败。

（二）泡菜制作流程：
将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过菜料，盖好坛盖；
用清水和食盐配制质量百分比为5%-20%的盐水，并将盐水煮沸，冷却待用；
配制盐水
原料处理、蔬菜装坛
加盐水
封坛发酵
向坛盖边缘的水槽中注满水，并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水；
根据室内温度控制发酵时间；
将新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装入泡菜坛内；装至半坛时，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满；
过高：乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；
过低：杂菌易繁殖，导致泡菜变质。
杀菌除氧
创造无氧环境
在泡菜发酵初期，酵母菌等较为活跃，发酵产物中有较多的CO2，防止发酵液溢出坛外；
防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂；
同时留有一定空间，也更方便拿取泡菜。
3.泡菜制作流程：
(三）果酒和果醋的制作
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}项目
果酒制作
果醋制作
发酵
原理
有氧条件下,酵母菌进行有氧呼吸,大量繁殖： ????????????????????????????+?????????????→?????????????????+????????????????? ;
无氧条件下,酵母菌通过无氧呼吸产生酒精：????????????????????????????酶??????????????????????????????+?????????????????+能量
氧气、糖源充足时,醋酸菌将葡萄汁中的葡萄糖分解成乙酸：
????????????????????????????+?????????????酶??????????????????????????????????+?????????????????+?????????????????+ 能量；
缺少糖源,氧气充足时,醋酸菌直接将乙醇转化为乙醛,再将乙醛变C2H5OH+O2酶CH3COOH+H2O+能量
温度
发酵温度为18-30℃ ,酿酒酵母最适生长温度约为28 ℃
最适生长温度为30-35℃
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}项目
果酒制作
果醋制作
发酵
原理
温度
最适生长温度为30-35℃
制作流程
清洗、消毒装置
清洗原材料
榨汁、装瓶
酒精发酵
果酒
果醋发酵
果醋
将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用
取新鲜葡萄，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干
榨汁，将葡萄汁装入发酵瓶中，留约1/3的空间，盖好瓶盖
①将温度控制在18-30℃
②每隔12h左右将瓶盖拧松一次，此后再拧紧瓶盖
③发酵时间为10-12d
④从发酵瓶口取样，随时对发酵情况进行检测
a.葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布
b.发酵温度为30-35℃
c.发酵时间为7-8d
二、培养基的配制
1.概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质
2.种类：液体培养基和固体培养基,二者的区别为是否添加凝固剂
3.营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外,还需要满足微生物生长对
pH 、氧气以及特殊营养物质的要求
例如：
（1）在培养乳酸杆菌时,需要在培养基中添加维生素
（2）在培养霉菌时,需要将培养基调至酸性
（3）在培养细菌时,需要将培养基调至中性或弱碱性
（4）在培养厌氧微生物时,需要提供无氧的条件
?
物理性质
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
不含凝固剂，用于工业生产等
含凝固剂，用于观察微生物的运动等
含琼脂凝固剂，用于微生物的分离、鉴定、计数、保藏等
功能
选择培养基
鉴别培养基
允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同类型的微生物
种类
三、无菌技术
是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
消毒
灭菌
1. 消毒与灭菌的概念
接种室、接种箱或超净工作台可用紫外线照射30min
100℃煮沸5-6 min
62-65℃下煮30 min或80-90℃处理30s-1min
2.常用的消毒方法
用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源等
煮沸消毒
巴氏消毒
化学药剂消毒
紫外线消毒
160-170℃的热空气中加热2-3h。常用于玻璃器皿和金属器具。
常用于接种工具，如接种环、接种针、涂布器等，以及试管口、瓶口等的灭菌。
3.常用的灭菌方法
利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌。高压蒸汽灭菌效果最好，100 kPa、121℃下维持15-30 min，常用于培养基、无菌水等的灭菌。
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
4.微生物的纯培养
(1)概念：由_________繁殖所获得的微生物群体是纯培养物，获得_________的过程就是纯培养。
(2)过程：包括___________、灭菌、接种、_____和培养等步骤。
(3)常用方法：_________法和_____________法。
单一个体
纯培养物
配制培养基
分离
平板划线
稀释涂布平板
(4)实例——酵母菌的纯培养
四、微生物的选择培养
知识梳理
1.方法：稀释涂布平板法
2.操作步骤
a .取样
b .取 10?g 土样加入 90?mL 无菌水中摇匀,然后依次等比稀释

?
c .取 0.1?mL 菌液,滴加到培养基表面
?
知识梳理
d .涂布
e .平板倒置
待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入30?37℃的恒温培养箱中培养 1?2?d 。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落
?
2.操作步骤
项目
间接计数法（稀释涂布平板法）
直接计数法（显微镜计数法）
原理
当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量
缺点
当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
提醒 设置对照和重复
①对照
目的：排除非测试因素对实验结果的影响。
方法：
空白对照：确定培养基制作是否合格
条件对照：用完全培养基与选择培养基对照,说明选择培养基具有选择作用
②重复
目的：排除偶然因素对实验结果的影响
方法：同一稀释度涂布至少3个平板
重点难点
3.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
图示
关键操作
接种环在固体培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释；
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高,为确保实验成功可以增加稀释度的范围
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
菌体获取
在具有所需显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落,又能对微生物进行计数
缺点
不能对微生物进行计数
操作复杂,需要涂布多个平板
5.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
葡萄糖
10.0g
尿素
1.0g
KH2PO4
1.4g
Na2HPO4
2.1g
MgSO4·7H2O
0.2g
琼脂
15.0g
蒸馏水
1000ml
五、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
1）培养基的制备
对照作用
思考：为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层。取样时一般要铲去表层土3-8cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。注意：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
2）土壤取样
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
3)样品的稀释
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}组别
具体组别
具体操作
作用
实验组
实验组1
涂布接种的选择培养基
三次重复排除偶然因素对实验结果的影响，用以分离并计数能分解尿素的细菌。
实验组2
涂布接种的选择培养基
实验组3
涂布接种的选择培养基
实验组4
涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基
实验组4与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基是否具有选择作用。
对照组
对照组1
不涂布接种的选择培养基
对照组1与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基中是否含有杂菌。
对照组2
不涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基
对照组2与实验组4 对比用以验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。
实验结果
实验组1、2、3分离得到尿素分解菌的单菌落；
第4组得到多种菌落；
第5、6组正常情况下无菌落。
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
4)微生物的培养与观察
a.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落
空白对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
b.样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
5) 结果分析与评价
知识梳理
选育菌种
扩大培养
接种
发酵罐
内发酵
分离、提纯产物
获得产品
配制培养基
灭菌
从自然界筛选，也可以通过诱变育种或者基因工程于中获得
促使菌种数量快速增长满足发酵生产的需求
发酵工程的中心环节；随时检测培养液中微生物的微生物数量、产物浓度等，及时添加必需营养组分，严格控制温度、PH 和溶解氧等发酵条件
代谢物：根据产物的性质提取分离和纯化
菌体本身：过滤、沉淀等
重点难点
一、发酵工程的基本环节
培养物或营养物质
的加入口
阀门
放料管 作用：控制培养物以一定速度进入、流出发酵罐实现连续培养
空气入口 作用：控制溶解氧
观察孔
取样管
作用：抽取样本进行检测
温度传感器和控制装置
冷却水进入口
冷却水排出口
冷却装置的作用：调节罐温
冷却夹层
发酵液
排气管 作用：调节罐压
ph计
电动机
搅拌叶轮 作用：使微生物与发酵液混合均匀，加快O2的溶解以及散热
生物传感器装置
1.发酵工程的特点（优点）
①生产条件温和；
②原料来源丰富且价格低廉；
③产物专一；
④废弃物对环境的污染小和容易处理
2.发酵工程的应用
发酵工程在食品工业、医药工业、农牧业以及其他方面等许多领域得到广泛应用，形成规模庞大的发酵工业
①在食品工业上的应用
a .生产传统的发酵产品
下图为啤酒的工业化生产：
?
知识梳理
发芽
烘培
碾磨
糖化
蒸煮
发酵
消毒
终止
主要原料：
大麦和水
作用：释放淀粉酶
加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活
将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉
设备：糖化罐
淀粉
淀
粉
酶
糖浆
啤酒花
冷却
过滤
作用：产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌
作用：杀死啤酒中的大多数微生物，延长啤酒的保存期
过滤、调节、分装啤酒进行出售
知识梳理
啤酒的工业化生产中发酵分为：
主发酵阶段：糖 酒精和二氧化碳
酵母菌
后发酵阶段：低温、密闭环境储存，使啤酒澄清、成熟
b .生产各种各样的食品添加剂
c .生产酶制剂
?
（2）在医药工业上的应用
a .青霉素的发现和产业化生产推动了发酵工程在医药领域的应用和发展
b .发酵工程逐步扩展到了其他抗生素多种氨基酸、激素和免疫调节剂等的生产领域
（3）在农牧业上的应用
a .生产微生物肥料 b .生产微生物农药 c .生产微生物饲料
（4）在其他方面的应用
发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域,在助力解决粮食、环境、健康和能源等方
面的重大问题上,作出了越来越大的贡献
?
1.下列关于传统发酵技术应用的叙述，正确的是
A.利用乳酸菌制作泡菜过程中，先通气培养，后密封发酵
B.家庭制作果酒、果醋通常都不是纯种发酵
C.果醋制作过程中发酵液pH逐渐降低，果酒制作过程中情况相反
D.酵母菌中只存在一种与蛋白质合成有关的细胞器——核糖体
√
2.(2022·泰州市高三上学期期中)泡菜在发酵期间，由于乳酸菌的发酵作用，乳酸不断积累，因此可以根据微生物的活动情况和乳酸积累量，将泡菜发酵过程分为三个阶段。下列说法错误的是
A.初期由于含有氧气且pH较高，坛内存在其他微生物的生长
B.中期由于乳酸不断积累，厌氧状态形成，乳酸菌成为优势种
C.后期由于乳酸含量继续增加，发酵速度会逐渐变缓甚至停止
D.整个发酵过程中亚硝酸盐含量不断增加，故泡菜要尽早食用
√
11.下列有关发酵技术在食品加工中应用的叙述，正确的是
A.为了避免杂菌污染，乳酸菌发酵酸奶时在牛奶中添加一定量的抗生素
B.为了提高果酒品质，挑选新鲜葡萄去除枝梗后用蒸馏水反复冲洗再榨汁
C.为了防止果酒变酸，果酒发酵应避免排气时空气进入及发酵引起的升温
D.在果醋发酵过程中，要适时通过充气口充气，有利于酵母菌的代谢
√
3.啤酒是以麦芽汁为原料，经酿酒酵母发酵制得。传统啤酒酿造过程中，发酵在敞开式发酵池中进行，麦芽汁中接入酵母后通入大量无菌空气，之后会产生大量气体翻腾逸出，在麦芽汁表面形成25～30 cm厚的气泡层(泡盖)，然后停止通气，进入静止发酵阶段。一段时间后可得啤酒。下列说法错误的是
A.用赤霉素溶液浸泡大麦种子可以有效促进α-淀粉酶合成，增加麦芽汁
　中可发酵糖的含量
B.静止发酵阶段酵母菌主要进行无氧呼吸
C.泡盖的形成是由于酵母菌有氧呼吸产生CO2，能将麦芽汁与空气隔绝
D.麦芽汁仅能为酿酒酵母的发酵过程提供碳源和水
√
4.(2022·宁波市高三适应性考试)下图为分离以尿素为氮源的微生物的实验结果，下列叙述正确的是
A.图中采用平板划线法接种
B.图中①和②表示尿素培养基
　长出的菌落
C.图中③④培养基中菌落生长代谢时，会释放CO2
D.实验结果表明，自然界中能合成脲酶的微生物比例较高
√
5.某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是
A.可得出土壤样液中活菌数大约为5.7×107个/L
B.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低
C.一般选择菌落数在30～300的平板进行计数
D.显微镜直接计数法统计的都是稀释液中活菌数
√
6.某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”的实验，具体操作流程如图所示。下列相关叙述不正确的是
A.在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中
B.梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作
C.振荡的目的是为了增加尿素分解菌的浓度
D.由图示菌落计数结果可知10克土样中的菌株数约为1.6×107个
√
7.下图为实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作步骤，下列说法不正确的是
A.①步骤使用的培养基是已经灭菌的培养基
B.①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
C.③到④的过程中，接种环共灼烧了5次
D.④步骤操作时，不能将第1区和第5区的划线相连
√
二、非选择题
8.(2022·广东六校联盟高三联考)为了检测牛奶中是否含有某种微生物，配制的培养基的配方如下，请分析回答下列问题(注：伊红—亚甲蓝是由两种染色剂组成的细胞染料)：
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
伊红
亚甲蓝
蒸馏水
10 g
5 g
5 g
2 g
0.4 g
0.065 g
1 000 mL
将培养基pH调至7.2
(1)根据配方，该培养基可用来培养 (填“细菌”“霉菌”或“细菌与霉菌”)，其所含氮源的功能是 。
(2)该微生物在同化作用上的代谢类型是 型，其在培养基上产生的单个菌落在生态学中被称为 。
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
伊红
亚甲蓝
蒸馏水
10 g
5 g
5 g
2 g
0.4 g
0.065 g
1 000 mL
将培养基pH调至7.2
细菌
主要用于合成蛋白质、核酸
异养
种群
(3)接种好的培养皿在恒温箱中培养时要倒置，目的是________________
___________________________。
防止冷凝水滴落在
培养基上；避免水分过快蒸发
(4)有同学为统计消毒后的牛奶中该微生物的含量，取5 mL牛奶样液进行了下图操作，每个平板中的统计结果为87、83、85，则经过消毒后的牛奶中该微生物的含量大约是 个·mL－1。用该方法统计样本菌落数时 (填“是”或“否”)需要设置空白对照组，目的是_____
_____________________。
85 000(8.5×104)
是
用于
判断培养基是否被污染
第1章

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