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(共17张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第三章 基因工程
本节聚焦
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
一条小虫引发的科技大战
(中国农科院棉花研究所开发抗虫棉纪实)
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
P76 从社会中来
培育转基因抗虫棉的简要过程
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
与载体拼接
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
（核心）
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
Bt基因
苏云金杆菌
P76 从社会中来
一、目的基因的筛选与获取 P76
（一）目的基因：
概念
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
实例
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因--Bt抗虫蛋白基因
思考:如何筛选目的基因呢？
筛选方法
从相关的
已知结构
和功能清晰
的基因中进行筛选
已知结构
科学家掌握了Bt基因的序列信息。
功能清晰
Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响。
（二）筛选合适目的基因：
一、目的基因的筛选与获取 P77
利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
先对目的基因进行扩增
思考:获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？
抗虫基因
快速获得大量抗虫基因
苏云金杆菌
提取
合作探究：请同学们自主阅读教材P76-77，小组合作思考讨论完成问题。
1.总结出PCR的概念、提出者、原理、目的、优点。
2.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？所需设备是什么？
3.构建出PCR的大致过程。
4.PCR扩增为什么需要引物？
5.如何对产物进行鉴定？
6. PCR技术与DNA复制过程比较？
一、目的基因的筛选与获取 P77
1
中文全称：
2
原理：
3
操作环境：
4
基本条件：
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
①模板：
②原料：
③酶：
④其他条件：
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
一、目的基因的筛选与获取 P77
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
5
优点：
可在短时间内大量扩增目的基因
PCR扩增仪
PCR技术所需的基本条件
参与的组分 在PCR中的作用
前提条件
高温
模板DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
2种引物
一定的缓冲溶液(Mg2＋)
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
主要是DNA单链或RNA,使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
已知基因的核苷酸序列
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
所需的基本条件
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
相关信息
什么是引物？引物的作用是什么？P77
定义：引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）
作用：为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
解旋酶
由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。
作用：打开DNA双链（若是在体外可以用高温代替解旋酶打开DNA双链）
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
6
过程：P78-79
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
思考:PCR扩增需要引物的原因？
8
产物进行鉴定：P79
7
结果：P78
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。P84
PCR技术 DNA复制
相同点 模板
原料
不同点 解旋 方式
场所
酶
能量
结果
DNA的两条母链
四种脱氧核苷酸
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
dNTP（原料）提供
细胞内的ATP提供
PCR技术与DNA复制过程的比较
当堂训练
3.(2021·东莞)PCR是一项体外扩增DNA的技术,需在反应溶液中添加模板、原料、酶等物质,通过加热(90 ℃以上)使模板DNA解旋,冷却后在一定温度(72 ℃左右)下利用DNA聚合酶合成子代脱氧核苷酸链,如此循环往复,可使特定DNA片段以指数形式扩增。与体内DNA复制相比,有关PCR技术叙述错误的是 (　　)
A.以DNA分子的一条链作为模板
B.添加的DNA聚合酶热稳定性较高
C.反应溶液中无须额外添加解旋酶
D.新合成的DNA分子会作为复制模板
A
13.PCR一般要经过30多次循环,从第二次循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将 (　　)
A.仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B.与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C.同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸
D.无须与引物结合,在酶的作用下从头合成子链
B
【金版学案】P133
【金版学案】P134
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
90℃以上，双链DNA解聚为单链
B.复性
50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合
C.延伸
72℃左右，4种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
题后解法：回归教材P78-79
PCR反应过程示意图
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
P77-78
题后解法：回归教材P78-79
PCR反应过程示意图
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
目的基因
思考
1、引物在PCR中能重复利用吗？
不能
2、用PCR可以扩增mRNA吗？(P79旁栏思考题）
不能，由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。
PCR应用——新冠病毒核酸检测

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