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(共56张PPT)
二 微生物的选择培养和计数
第2节 微生物的培养技术及应用
录
目
Contents
1
2
3
选择培养基
Selective medium
微生物的选择培养
Selective culture of microorganisms
微生物的数量测定
Determination of the number of microorganisms
Part 1
选择培养基
Selective medium
PCR是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
寻找耐高温的DNA聚合酶
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来？
筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的水生栖热菌保留下来。
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
启示
由以上例子可知，某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在这种条件下不能生存，因此可以通过这个原理从环境中获得某种特定种类的微生物。
实验室中微生物的筛选，可以应用这个原理吗？
1.实验室中微生物筛选的原理
人为提供 的条件（包括 、
和 等），同时 。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
2.选择培养基
在微生物学中，将允许 生长，同时
或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
特定种类的微生物
抑制
阻止
（1） 概念：
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件
添加某种化学物质
特殊碳、氮源
营养缺陷
水生栖热菌
酵母菌、霉菌等真菌
金黄色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
自养微生物
固氮菌
（2）类型：
70～80℃的高温
青霉素
高浓度食盐
石油是唯一碳源
不加碳源
不加氮源
培养基中加氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
长出各种各样的细菌
培养基
+氨苄青霉素
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
培养基
（3）举例：
怎样选择出抗氨苄（biàn）青霉素的细菌
如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质相对稳定，是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的细菌将尿素分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
土壤中的细菌能分解尿素的原因：
能合成脲酶
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
【思考·讨论】
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。
2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
这种培养基与普通培养基相比，区别只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
(1)选择培养基只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物的生长(　　)
(2)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基(　　)
(3)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源(　　)
判断正误
√
√
×
1.(2021·山西大同月考)分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是
选项 尿素 琼脂 葡萄糖 硝酸盐
A ＋ ＋ ＋ ＋
B － － － －
C ＋ ＋ ＋ －
D ＋ － － ＋
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
√
解析　分离土壤中分解尿素的细菌，应在固体培养基中培养，培养基中要有碳源，且尿素作为唯一的氮源，故不能添加硝酸盐。
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2.尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制选择培养基时
A.葡萄糖在培养基中越多越好
B.尿素分解菌有固氮能力，故培养基中只需无机氮
C.尿素在培养基中越少越好
D.尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮
√
解析　葡萄糖在培养基中并不是越多越好，葡萄糖过多会使培养基的渗透压过高，不利于尿素分解菌的生长繁殖，A错误；
尿素分解菌没有固氮能力，故培养基中需要添加尿素作为氮源，B错误；
添加尿素的目的是筛选尿素分解菌，其他微生物不能很好地生活在该培养基上，尿素在培养基中不是越少越好，过少就会失去选择作用，过多又会使细胞失水死亡，C错误。
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Part 2
微生物的选择培养
Selective culture of microorganisms
由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，应该怎么做？
问
要对土壤进行___________，然后再将菌液_______到制备好的_____________上。
充分稀释
涂布
选择培养基
稀释涂布平板法
稀释涂布平板法：
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
两个基本操作：____________和___________。
梯度稀释
涂布平板
1.梯度稀释：
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
（1）土壤取样
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
注意
（2）样品的稀释
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
1×10
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
2.涂布平板
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
各梯度分别涂布3个平板，1个不涂布作空白对照
一滴、二浸、三烧、四涂
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；
特别提醒
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰附近进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
常用微生物分离方法比较
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具
主要 步骤
特点
共同点 接种环
涂布器
方法简单，但不适宜计数
单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板
接种环在固体培养基表面连续划线
梯度稀释和涂布平板
都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
1.图甲所示是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙所示是平板划线法的操作结果。下列相关叙述错误的是
A.图甲中涂布前要将涂布器
　灼烧，冷却后才能涂布菌液
B.对于浓度较高的菌液，若
　图甲中的最高稀释倍数仅
　为102，则所得到的菌落
　不一定是由单一的细胞繁殖而成的
C.图乙所示培养皿中每个划线区域都可得到符合要求的菌落
D.图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端(除第一次划线外)
√
解析　平板划线法中多次划线的目的是降低菌种浓度，经过连续划线才有可能得到由单一的细胞繁殖而成的菌落，这种菌落才符合要求，C错误。
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2.(2021·夏津第一中学高二月考)下图表示探究高效耐低温原油降解菌YF28－1(8)降解原油的最适温度实验的结果，5组实验中的温度t1～t5逐渐递增。下列相关叙述正确的是
A.对本实验中使用的接种工具——接种环采用灼烧灭菌法灭菌
B.实验中应注意控制温度、接种的菌液量等无关变量
C.温度为t1的培养皿为对照组，其他4组均为实验组
D.若要确定更精确的最适温度，应在t2～t4内设置更小的温度梯度
√
解析　分析题图可知，图中平板上的菌落均匀分布，说明使用的接种方法是稀释涂布平板法，使用的接种工具是涂布器而非接种环，A错误；
该实验探究原油降解菌降解原油的最适温度，因此温度在本实验中为自变量，接种的菌液量为无关变量，B错误；
实验中五组的温度都不同，该五组均为实验组，不同实验组之间相互对照，C错误。
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3.(2021·山东泰安高二期中)研究小组为了探究覆盖保鲜膜对西瓜表面微生物的种类和数量的影响，他们将覆盖保鲜膜保存了三天的西瓜的瓜瓤制备成浸出液，再将浸出液接种到培养基平板上进行观察。下列说法正确的是
A.应用液体培养基接种浸出液进行培养
B.应采用平板划线法对浸出液进行接种
C.每组至少设置三个平板，确保实验结果的准确性
D.只需要设置未接种瓜瓤浸出液的空白平板作对照
√
解析　要探究微生物种类和数量的变化，应采用固体培养基，用稀释涂布平板法进行接种，液体培养基无法观察到菌落，不便区分微生物种类，平板划线法不能对微生物进行计数，A、B错误；
每组至少设置三个平板，避免偶然性，确保实验结果的准确性，C正确；
对照组还需要设置接种没有覆盖保鲜膜的西瓜的瓜瓤浸出液，D错误。
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Part 3
微生物的数量测定
Determination of the number of microorganisms
计数：测定分解尿素的细菌的数量
稀释涂布平板法
显微镜直接计数法
——间接计数法
——直接计数法
1.间接计数法 ——稀释涂布平板法
当样品的稀释度足够 时，培养基表面生长的一个 __ ，来源于 中的一个 。通过统计平板上的 数，就能推测出样品中大约含有多少 。
（1）原理：
高
样品稀释液
活菌
菌落
活菌
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。
单菌落
（2）计数原则：
①选择菌落数为 的平板进行计数；
② 稀释度下，应 对 个平板进行重复计数，然后求出 。
③统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。
④统计结果一般用 而不是用活菌数来表示。
30~300
同一
至少
3
平均值
少
菌落数
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（3）计算公式：
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
（234÷0.1）×106=2.34×109
答
B
例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
请评价这两位同学的实验结果的有效性：
1.甲同学____________________________________；
原因是______________________________________。
2.乙同学____________________________________；
原因是______________________________________。
实验操作不合理
未设置重复实验组
结果计算不合理
21与另外两组数值相差太大，应舍去
2.直接计数法 ——显微镜直接计数法
（1）原理：
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
血细胞计数板：
细菌计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
（3）缺点：
a.不能区分死菌和活菌→偏大；
（2）优点：
快速、直观
b.不适于对运动细菌的计数；
c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。
注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。
1.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是
A.3号试管中样品液的稀释倍
　数为104倍
B.对4号试管中的稀释液进行
　平板培养得到的菌落平均
　数可能恰为5号试管的10倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的活菌数为1.7×108
D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低
√
解析　5号试管的结果表明每克土壤中活菌数为(168＋175＋167)÷3÷
0.1×106＝1.7×109，C错误；
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用这种计数方法得到的结果往往比活菌的实际数目低，因为有可能多个细菌形成一个菌落，D正确。
2.(2021·山东日照高二期中)研究小组利用稀释涂布平板法来探究土壤中分解尿素的细菌的数量。每一个浓度涂布四个平板，并且设置空白对照组。下列关于操作步骤的叙述正确的是
A.涂布前，将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布
　器冷却后，再进行涂布
B.涂布完成后，在培养皿的皿盖上做标记，以避免混淆，并将培养皿倒
　置培养
C.计算平板上的菌落数时，四个培养皿上的菌落数无论多少，都要全部
　统计并计算平均值
D.若空白对照组上有5个菌落，则实验组数据基础上减去5，以获得最准
　确数据
√
解析　涂布完成后，在培养皿的皿底做标记，B错误；
若空白对照组上有5个菌落，说明培养基灭菌不彻底，需要重新进行实验，D错误。
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3.(2021·天津静海一中高二月考)下列有关微生物分离、纯化、计数及培养的叙述中，正确的是
A.测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105、1×106倍稀释的
　稀释液进行平板培养
B.菌落的大小、颜色、有无荚膜、隆起程度等特征都可作为菌种鉴定的依据
C.用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往偏小
D.将好氧型菌株接种到培养液中需静置培养，防止培养液沾染试管壁
　引发污染
√
解析　菌落的大小、颜色、隆起程度等特征都可作为菌种鉴定的依据，但是有无荚膜通过肉眼无法观察，B错误；
用血细胞计数板计数微生物时，因死菌、活菌都计算在内，因此，实验结果往往偏大，C错误；
将好氧型菌株接种到培养液中需振荡培养，D错误。
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土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.实验目的
（1）从土壤中分离出能分解尿素的细菌
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素。利用 的_____培养基，可以从土壤中分离出 的细菌。
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
【探究 实践】
3.操作步骤
（1）土壤取样
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素作为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用
选择培养基的制备
配方：
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
①提供无机盐；
②调节pH
（3）样品稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
思考
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
①每个浓度至少设置4个平板
选择培养基（平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基
②本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
例：标记注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
（5）结果分析与评价
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
2. 你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果得到了两个或多个菌落数为30~300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
3. 你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
需要用“鉴别培养基”
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定。
分解尿素细菌的进一步鉴定
1.原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。
红
2.方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况。
固体培养基：
在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应，从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基
鉴别纤维素分解菌
鉴别培养基：

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