资源简介

(共21张PPT)
获得目的基因后直接转入受体吗？
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
目的基因
筛选方法
获取方法
人工合成
概念
作用
PCR扩增技术
基因文库
不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
1.为什么获得目的基因不能直接转入受体细胞？
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
阅读课本80页的内容，回答下面问题：
1．构建基因表达载体的目的是什么？
2．基因表达载体的组成有哪几部分？
3．标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？
4．构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？
5．为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？
1．构建基因表达载体的目的是什么？
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成有哪几部分？
目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切割位点
位置：基因的上游
功能：是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位置：基因下游
作用：使转录在所需的地方停止下来。
供目的基因插入载体中
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
基因表达载体的组成
3．标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？
作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因
常用的标记基因为抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因。
质粒
4．构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？
目的基因要插入启动子和终止子之间，这是因为启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确目的基因才能正常转录。
5．为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？
标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。
基因表达载体构建的流程
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
DNA
连接酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
限制酶切割位点
质粒
重组
DNA分子
限制酶
限制酶
考点辨析
1.限制酶的选择
1．右图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因重组进该质粒，则扩增的该基因两端需分别引入的两种限制酶的识别序列是(　　)
A　[根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于XbaⅠ在质粒上不止一个酶切位点，因此为使PCR扩增的该基因重组进该质粒，扩增的该基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种不同限制酶的识别序列。]
A. NdeⅠ和BamHⅠ B. NdeⅠ和XbaⅠ
C. XbaⅠ和BamHⅠ D. EcoRⅠ和KpnⅠ
2．图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是(　　)
A. 在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，则可选EcoRⅠ
B. 如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRⅠ酶切点有1个
C. 为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理
D. 一个图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
B　
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
1.将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有：
2.如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？
使用两种不同的限制酶：①防止目的基因和载体的自身环化
②防止目的基因与载体的反向连接
[归纳总结]　选择限制酶的技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。
考点辨析
2.启动子、终止子、起始密码子、终止密码子辨析
1.下列有关基因工程中启动子的说法正确的是(　　)
A. 启动子是一段特殊的RNA片段
B. 启动子是DNA聚合酶的识别和结合位点
C. 启动子可以驱动基因的转录
D. 启动子和起始密码子是同一概念
B
密码子：指信使RNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基。信使RNA上四种碱基的组合方式有64种，其中，决定氨基酸的密码子有61种，另外3种是终止密码子。
终止密码子：是信使RNA上能够终止蛋白质合成的密码子。
起始密码子：位于信使RNA上，是蛋白质合成开始的信号，有两种：AUG、GUG。
(1)从定义上区分
启动子和终止子都是DNA分子中具有调控作用的脱氧核苷酸序列，而起始密码子和终止密码子都位于信使RNA上，分别是翻译的起始位置和终止位置，终止密码子不能决定任何一种氨基酸。
(2)从本质上区别
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程
起始 密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止 密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
基因表达载体的构建
载体构建原因
DNA片段无法稳定存在
DNA片段无法进行复制（遗传）
载体组成
限制酶切割位点
启动子
终止子
复制起点
标记基因
位置：基因的上游
功能：是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位置：基因的下游
作用：使转录在所需的地方停止下来。
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因

展开更多......

收起↑