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第4节 蛋白质工程的原理和应用
科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？
最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了各种颜色的荧光蛋白。
1.基因工程的实质：
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
2.基因工程的不足：
基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质
这些天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
实例
赖氨酸
（天冬氨酸激酶的第352位的苏氨酸变成异亮氨酸）
二氢吡啶二羧酸合成酶
天冬氨酸激酶
（二氢吡啶二羧酸合成酶的第104位的天冬酰胺变成异亮氨酸）
提高5倍
提高2倍
底物
抑制
1.蛋白质工程的目标：
转录
DNA
RNA
翻译
肽链
折叠
具有空间结构的蛋白质
表达生物特有的功能或性状
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造
2.蛋白质工程的方法：
通过改造或合成基因，来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质。
决定
3.蛋白质工程的基本思路：
预期功能
生物功能
设计
蛋白质
（三维结构）
推测
改造或合成
转录
翻译
折叠
行使
目的基因
mRNA
多肽链
3.蛋白质工程的基本思路：
预期功能
生物功能
推测
合成或改造
翻译
折叠
转录
目的基因
蛋白质
结构
氨基酸序列的多肽链
mRNA
设计
行驶
思考·讨论
丙氨酸 ：
色氨酸：
赖氨酸：
谷氨酸:
苯丙氨酸：
某多肽链的一段氨基酸序列是：
蛋白质工程基本思路的应用
mRNA序列：
DNA序列:
丙氨酸
色氨酸
赖氨酸
谷氨酸
苯丙氨酸
…
…
GCT TGG AAA GAA TTT
思考1. 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列
查密码子表
GCU、GCC、GCA、GCG
UGG
AAA 、AAG
GAA、GAG
UUU 、UUC
GCU UGG AAA GAA UUU
CGA ACC TTT CTT AAA
思考·讨论
蛋白质工程基本思路的应用
思考2. 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因
确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因。
对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
基因定点突变：是在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术,包括盒式取代诱变、寡核苷酸引物诱变及PCR定点诱变等。
基因定点诱变技术的示意图
预期功能
生物功能
设计
蛋白质
（三维结构）
推测
改造或合成
转录
翻译
折叠
行使
目的基因
mRNA
多肽链
3.蛋白质工程的基本思路：
预期的蛋白质功能
设计预期的蛋白质结构
推测应有的氨基酸序列
找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因
获得所需蛋白质
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
4.蛋白质工程的概念：
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
基因
改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求
基础
操作对象
目的
地位
在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
①蛋白质工程获得目的基因后，需要通过基因工程获得预期蛋白质
②蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程
课堂总结
生产自然界不存在的蛋白质
生产自然界已存在的蛋白质
蛋白质工程:
基因工程:
由计算机建立的血红蛋白三维结构模型
三
级
结
构
一
级
结
构
四
级
结
构
二
级
结
构
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构。
这种高级结构很复杂，目前对其了解还很不够，还需探索。
蛋白质工程——难度大
原因：
第一次循环
3’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
第二次循环
第三次循环
GAATTC-
-CTTAAG
-CTTAAG
-CTTAAG
-CTTAAG
GAATTC-
GAATTC-
GAATTC-
CTTAAG-
-GAATTC
-CTTAAG
-CTTAAG
-CTTAAG
-CTTAAG
-CTTAAG
-CTTAAG
-CTTAAG
GAATTC-
GAATTC-
GAATTC-
GAATTC-
GAATTC-
GAATTC-
GAATTC-
-GAATTC
CTTAAG-
-GAATTC
CTTAAG-
CTTAAG-
CTTAAG-
-GAATTC
-GAATTC
5’
3’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
3’
思考：如何在目的基因两侧加上限制酶识别序列？
PCR的应用
1、获取目的基因
2、扩增目的基因
3、检测目的基因是否插入到染色体DNA上
4、检测目的基因是否转录出mRNA
5、检测目的基因是否与启动子相连
6、基因定点突变
7、在目的基因两侧加上限制酶识别序列
关键：合理设计引物
①目的基因的两端；②限制酶识别序列的外侧
在目的基因上
一个引物在启动子，另一个引物在目的基因
改变引物上的碱基（替换、增添、缺失）
在引物的外侧（5’端）加上限制酶识别序列
导入
1、导入目的基因
正向导入目的基因
反向导入目的基因
2、导入（诱导型）启动子
3、导入融合基因
4、导入改造过的基因
---蛋白质工程（生产自然界没有的蛋白质）
---让两基因同步表达
---调控基因的表达
---获得基因表达产物
---”中和”细胞中RNA
天然蛋白质易形成二聚体或六聚体
预期功能
降低胰岛素的聚合作用
设计结构
改变B链第20～29位氨基酸组成可能降低胰岛素分之间的作用力
改造
新胰岛素基因
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
推测序列
转录
mRNA
翻译
多肽链
行使功能
有效抑制胰
岛素的聚合
1.研发速效胰岛素类似物
空间结构
折叠
定点突变
速效胰岛素
天然干扰素不易保存改造新干扰素基因预期功能延长保存时间设计结构蛋白质结构一个半胱氨酸变成丝氨酸推测序列空间结构转录mRNA折叠翻译多肽链行使功能在-70℃下可以保存半年2.延长干扰素体外保存时间β-干扰素氨基酸序列定点突变3.降低人对小鼠单抗隆抗体的免疫反应
通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会减低很多。
基因融合
融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连
4.改进酶的性能或开发新的工业用酶。
5.改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加粮食的产量。
6.设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
7.提高蛋白质的热稳定性
第3位上的
异亮氨酸
半胱氨酸
-s-s-
定点突变
1.下列关于蛋白质工程的说法，错误的是( )
A.蛋白质工程能定向改造蛋白质的分子结构，使之更加符合人类的需要。
B.蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子结构。
C.蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子。
D.蛋白质工程与基因工程密不可分，又称为第二代基因工程。
B
2.下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答下列问题：
（1）代表蛋白质工程操作思路的过程是_____；代表中心法则内容的是________。(填写数字)
（2）写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容： ①______；②______；③______；④______；⑤__________。
（3）蛋白质工程的目的是_______________________________________ _____________________，通过___________________实现。
（4）从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是______的。
④⑤
①②③
转录
翻译
折叠
推测
改造合成
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白
质的结构进行设计
基因改造或合成基因
相反
3.IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1183位碱基T突变为C,导致IKK上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制,研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合),主要过程如图甲、乙。分析回答:
(1)在PCR反应体系中,需加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2+等外,还需加入　　　　 　等。
(2)在图甲获取突变基因过程中,需要以下3种引物:
则PCR1中使用的引物有　　　　　　,PCR2中使用的引物有　　　和图中大引物的　　　(填“①”或“②”)链。
(3)PCR的反应程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,30个循环。在循环之前的94 ℃ 3 min处理为预变性;循环中72 ℃处理的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0,并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因,请你设计完成获得SCID模型鼠的实验步骤:
①杂交亲本:　　　　　　　　,杂交得F1;
②F1雌、雄鼠随机交配得F2;
③提取F2每只小鼠的基因组DNA,采用分子生物学方法,利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选,
则　　　 　　 　　 　　 　　　 　　 　的为模型鼠。
耐高温DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸(dNTP)
引物A和引物B
引物C
②
耐高温的DNA聚合酶从引物起始进行互补链合成
F0×野生鼠
IKK基因探针检测未出现杂交带,突变基因探针检测出现杂交带
蛋白质的结构三级结构一级结构四级结构二级结构 U C A G
U 苯丙氨酸 丝氨酸 酪氨酸 半胱氨酸 U
苯丙氨酸 丝氨酸 酪氨酸 半胱氨酸 C
亮氨酸 丝氨酸 终止 终止、硒代半胱氨酸 A
亮氨酸 丝氨酸 终止 色氨酸 G
C 亮氨酸 脯氨酸 组氨酸 精氨酸 U
亮氨酸 脯氨酸 组氨酸 精氨酸 C
亮氨酸 脯氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 A
亮氨酸 脯氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 G
A 异亮氨酸 苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸 U
异亮氨酸 苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸 C
异亮氨酸 苏氨酸 赖氨酸 精氨酸 A
甲硫氨酸 苏氨酸 赖氨酸 精氨酸 G
G 缬氨酸 丙氨酸 天冬氨酸 甘氨酸 U
缬氨酸 丙氨酸 天冬氨酸 甘氨酸 C
缬氨酸 丙氨酸 谷氨酸 甘氨酸 A
缬氨酸、甲硫氨酸 丙氨酸 谷氨酸 甘氨酸 G
基因定点诱变技术的示意图
转录
DNA
RNA
翻译
肽链
逆转录
复制
复制
折叠
具有空间结构的蛋白质
表达生物特有的功能或性状
2. 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因
人工合成目的基因
改造或合成基因
2、改造蛋白质的方法：
预期的蛋白质功能
设计预期的蛋白质结构
推测应有的氨基酸序列
找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因
获得所需蛋白质
预期功能
生物功能
设计
推测
改造或合成
行使
折叠
目的基因
转录
mRNA
翻译
多肽链
蛋白质
(三维结构)
思
路
蛋白质工程的基本原理
逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反
1.动物体细胞核移植技术去核的方法是： P54
2.在畜牧业生产中，利用体细胞核移植技术可以加速 ，
促进 。
3.受精是指 和 结合形成 （即受精卵）的过程。包括受精前的 阶段和 阶段。在自然条件下，哺乳动物的受精在 内完成。
4.卵子一般在排出2-3h后才能被精子穿入，动物排出的卵子成熟度不同，有的可能是 ，有的可能是 。它们都要
在 中发育到 ，才具备与精子受精的能力。
每课默写（3min）：
显微操作法
家畜遗传改良进程
促进优良畜群繁育
精子 卵子 合子
准备阶段 受精
输卵管
初级卵母细胞 次级卵母细胞
输卵管 MⅡ期
医药卫生领域
食品工业方面
农牧业方面
基因工程的应用
3
转基因动物作为器官供体
①猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似。
②与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要少得多。
（2）最大难题是： ；
（3）器官改造方法：
（1）选用猪作为器官供体的原因
免疫排斥
①在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达
②设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
用___________的方法，使___________得到__________的菌类，一般称为基因工程菌
基因工程
外源基因
高效表达
基因工程构建基因工程菌
工业发酵批量生产
概念：
步骤：
应用：
利用基因工程菌，除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等
1
基因工程菌
：凝聚固化奶中的蛋白质
牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉、酵母中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶
制备方法：
主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸可通过基因工程实现大规模生产。
2
实例——阿斯巴甜：甜味剂
2
实例——凝乳酶
传统制备方法：
未断奶的小牛第四胃的黏膜取出来提取。
实例——淀粉酶、脂酶
2
基因工程获得的工业用酶的优点：
纯度更高、
生产成本显著降低、生产效率较高
　　基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。
1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来
1
环境监测
基因工程将能分解三种烃类的假单孢杆菌的基因都转移到能分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解四种烃类的“超级细菌”。
2
净化污染的环境
基因工程在其他方面的应用
蛋白质工程与基因工程的比较
项目 蛋白质工程 基因工程
区别 起点
过程
实质
结果
应用及现状
联系 预期蛋白质功能
目的基因
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质
获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
通过改造相应的基因达到对蛋白质进行改造的目的
基因重组
可以创造出自然界不存在的蛋白质
生产自然界已存在的蛋白质
①主要集中在对现有蛋白质进行改造，②对创造新的蛋白质还有许多技术难题未突破
①已被广泛应用，如转基因植物、动物、药品生产等已商业化
①蛋白质工程获得目的基因后，需要通过基因工程获得预期蛋白质
②蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程
课堂总结

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