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(共35张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
(第二课时)
第三章 基因工程
复习——培育转基因抗虫棉的基本步骤
普通棉花
（无抗虫特征）
苏云金芽孢杆菌
（有抗虫特征）
提取
抗虫基因
棉花细胞
与载体DNA拼接，导入
（含抗虫基因）
植物组织培养技术
转基因抗虫棉
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
复习——目的基因的筛选与获取
（1）人工合成
不需要模板
①DNA合成仪
②反转录法
需要模板
（2）从基因文库中获取
基因组文库
部分基因文库（cDNA文库）
不需要模板
（3）利用PCR技术获取和扩增目的基因
需要模板
复习——PCR技术
变性
复性
延伸
温度：90℃以上
温度：50℃左右
过程：两种引物通过碱基互补配对与
两条单链DNA结合
温度：72℃左右
过程：4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，添加在引物的
_____端，合成新的DNA链。
（引物结合在模板链的______端）
反复循环
过程：目的基因DNA双链受热变性后解聚为单链
3’
3’
基因表达载体的构建 (基因工程的核心)
构建目的：
① 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
② 同时使目的基因能够表达和发挥作用。
“基因表达载体”
是载体的一种
目的基因
标记基因
启动子
终止子
复制原点
基因表达载体的构建 (核心)
（1）启动子
本质：
一段有特殊序列的 DNA 片段
位置：
位于基因的上游，紧挨转录的起始位点
功能：
是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
特殊类型：
诱导型启动子
特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达
基因表达载体的构建 (核心)
（2）终止子
本质：
一段有特殊序列的 DNA 片段
位置：
位于基因的下游
功能：
使转录在所需的地方停下来
启动子vs起始密码子 终止子vs终止密码子
启动子vs起始密码子 终止子vs终止密码子
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学 成分
位置
作用
DNA片段
DNA片段
mRNA上
三个相邻碱基
mRNA上
三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
决定转录的结束
翻译的起始信号
决定翻译过程的结束
基因表达载体的构建 (核心)
（3）标记基因
作用：
类型：
便于重组DNA分子的筛选
抗生素抗性基因、荧光蛋白基因
（4）复制原点
作用：
使基因表达载体能完成自主复制
基因表达载体的构建 (核心)
构建过程：
目的基因
限制酶切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
切割目的基因的限制酶和切割基因表达载体的限制酶一定是同种限制酶吗？
？
同种限制酶或能产生相同黏性末端的限制酶
基因表达载体的构建 (核心)
构建过程：
目的基因
限制酶切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
？
同种限制酶或能产生相同黏性末端的限制酶
基因表达载体的构建 (核心)
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
为保证目的基因定向连接，往往选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因(一般不全破坏)、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
基因表达载体的构建 (核心)
1、下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ ）
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸
B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件
C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达
D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
√
练习
练习
2.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是( )
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
√
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——Ca2+处理法
——显微注射法
方法
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
重组质粒
将目的基因导入植物细胞——花粉管通道法
将目的基因导入植物细胞——花粉管通道法
方法2：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
方法1：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
操作方式
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
将目的基因导入植物细胞——花粉管通道法
操作方式
Ⅱ在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
Ⅰ用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
受体细胞
受精卵
地位
我国科学家独创的方法
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
①农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的_______可转移至被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 。
将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法（最常用）
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
实质是基因重组。
农杆菌特点：
②能在自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多单子叶植物没有侵染能力。
T-DNA
染色体DNA上
Ti质粒
原核生物
T-DNA
Ti质粒
大型环状DNA
农杆菌
将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法（最常用）
实验思路
“两次拼接”
“两次导入”
第一次拼接
第二次拼接(非人工操作)
第一次导入
第二次导入
(非人工操作)
两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法（最常用）
将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法（最常用）
实验具体操作
①可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片（即外植体），与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生植株。
受体细胞：体细胞
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等
将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法（最常用）
实验具体操作
①可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片（即外植体），与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生植株。
受体细胞：体细胞
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等
受体细胞：受精卵
将目的基因导入动物细胞——显微注射法
受体细胞：
受精卵
②体积大，易操作
①受精卵易表现出全能性，能培养成完整个体
原因：
基因表达载体提纯
受精卵
胚胎
雌性动物的输卵管或子宫内
显微注射
新性状的动物
早期胚胎培养
胚胎移植
发育
将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法
常用方法：
受体细胞：
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态——感受态
原核生物（常选择大肠杆菌）
Ca2+处理
目的
优点
遗传物质相对较少，易于培养，繁殖快。
将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法
常用方法：
受体细胞：
可使细胞处于感受态
原核生物（常选择大肠杆菌）
Ca2+处理
目的
优点
遗传物质相对较少，易于培养，繁殖快。
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
将目的基因导入受体细胞
1.一般不能用真核生物“完整的基因”构建重组质粒导入到原核生物中，原因可能是什么
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此无法表达出该蛋白。
载体
真核生物的基因
载体
导入
原核生物
将目的基因导入受体细胞
1.一般不能用真核生物“完整的基因”构建重组质粒导入到原核生物中，原因可能是什么
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此无法表达出该蛋白。
以上情况如何解决？
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
将目的基因导入受体细胞
2.若将cDNA导入受体细胞，基因表达出了相关蛋白，但该蛋白质无活性，原因可能是？
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行加工
以上情况如何解决？
人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——Ca2+处理法
——显微注射法
方法
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
受精卵
受精卵
受精卵or体细胞
原核生物
将目的基因导入受体细胞
练习
（2022·河北石家庄高二期中）我国科学家将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入某植物，富含赖氨酸的蛋白质编码基因编码区共含678个碱基对，科学家利用了XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入植物叶片细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高。如图所示是相关培育过程，下列说法正确的是
A.重组质粒利用SacⅠ和HindⅢ
　切割后能得到1 500 bp片段，
　则表明目的基因正确插入质粒
B.图中①过程采用农杆菌转化法，是因为农杆菌易侵染双子叶植物和裸子植物
C.植物组织培养过程中，培养基中添加卡那霉素或新霉素都可以用于筛选转基因植株
D.①过程前获得的重组质粒只需要两种工具，即限制酶和DNA连接酶
√
解析　根据所用限制酶在质粒上的切割位点可知，由于重组质粒上移除1 900 bp而插入了目的基因的678个碱基对，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1 500 (bp)的新片段，A正确；
图中②过程采用农杆菌转化法，①过程需要用Ca2＋处理，B错误；
插入植物细胞染色体上的是质粒的T－DNA片段，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，成功导入的植物细胞对卡那霉素无抗性，不能用卡那霉素筛选，C错误；
①表示将目的基因导入农杆菌细胞，①过程前获得的重组质粒需要三种工具，即限制酶、DNA连接酶和载体，D错误。
练习

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