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(共34张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
本节聚焦:
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
第三章 基因工程
（第一课时）
一条小虫引发的科技大战
—中国农科院棉花研究所开发抗虫棉纪实
思考问题：1.你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
2.培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？
3.将目的基因导入受体细胞
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
1.概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期
表达产物等的基因。
2.实例：
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因。
一、目的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
那么，如何筛选目的基因呢？
二、筛选合适的目的基因
序列数据库（如GenBank）
序列比对工具（如BLAST）
公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因
先对目的基因进行扩增
问题:获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？
抗虫基因
快速获得大量抗虫基因
苏云金杆菌
提取
【回顾】DNA复制的过程
先对目的基因进行扩增
问题:获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？
抗虫基因
快速获得大量抗虫基因
苏云金杆菌
提取
PCR
合作探究：请同学们自主阅读教材P76-77，小组合作思考讨论完成问题。
1.总结出PCR的概念、原理、目的、优点。
2.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？所需设备是什么？
3.构建出PCR的大致过程。
4.PCR扩增为什么需要引物？
5.如何对产物进行鉴定？
6. PCR技术与DNA复制过程比较？
三、利用PCR获取和扩增目的基因
原理
操作环境
目的
优点
全称
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可在短时间内大量
扩增目的基因
三、利用PCR获取和扩增目的基因
所需的基本条件
PCR技术所需的基本条件
参与的组分 在PCR中的作用
解旋酶（体外用高温代替）
DNA母链（模板）
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
一定的缓冲溶液(Mg2＋)
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
主要是DNA单链或RNA,使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
DNA聚合酶需要Mg2＋激活
引物
定义：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）
作用：为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
解旋酶
由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。
作用：打开DNA双链（若是在体外可以用高温代替解旋酶打开DNA双链）
3
5
3
5
3
5
5
3
引物
引物
5
3
5
3
三、利用PCR获取和扩增目的基因
所需设备
PCR扩增仪
DNA分子电泳
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程
三、利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
扩增过程
90
50
72
℃
变性
3`
5`
5`
3`
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程（巩固）
90
50
72
℃
复性
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程（巩固）
90
50
72
℃
延伸
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程（巩固）
90
50
72
℃
变性
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程（巩固）
90
50
72
℃
复性
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程（巩固）
90
50
72
℃
延伸
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程（巩固）
90
50
72
℃
变性
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程（巩固）
90
50
72
℃
复性
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程（巩固）
90
50
72
℃
延伸
三、利用PCR获取和扩增目的基因
扩增过程（巩固）
三、利用PCR获取和扩增目的基因
PCR的结果
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
产物鉴定：
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在
的位置和一系列已知大小的DNA片
段的位置(标准)，这些已知大小的
片段称为DNA分子量标准样。
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
目的基因
思考
1、引物在PCR中能重复利用吗？
不能
2、用PCR可以扩增mRNA吗？(P79旁栏思考题）
不能，由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。
PCR应用——新冠病毒核酸检测
PCR技术 DNA复制
相同点 模板 原料 不同点 解旋 方式
场所
酶
能量
结果
DNA的两条母链
四种脱氧核苷酸
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
PCR技术与DNA复制过程比较
dNTP（原料）提供
细胞内的ATP提供
1. 下列有关PCR技术的叙述,错误的是 (　　)
A.每一次循环后目的基因的数量可以增加一倍
B.PCR反应过程中需要3个不同的温度范围
C.PCR反应过程中加入的酶的显著特性是耐高温
D.模板DNA和引物能在每一次扩增中重复使用
任 务 活 动
D
任 务 活 动
2．PCR技术扩增DNA，需要的条件是（　　）
①目的基因 ②引物
③四种脱氧核苷酸 ④mRNA
⑤DNA聚合酶等 ⑥核糖体
A．①②③④ B．②③④⑤
C．①③④⑤ D．①②③⑤
3.下列有关PCR技术的说法，不正确的是(　　)
A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B．PCR技术的原理是DNA双链复制
C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列
D．PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA
任 务 活 动
任 务 活 动
4 .下列有关PCR技术的叙述,错误的是 (　　)
A.每一次循环后目的基因的数量可以增加一倍
B.PCR反应过程中需要3个不同的温度范围
C.PCR反应过程中加入的酶的显著特性是耐高温
D.模板DNA和引物能在每一次扩增中重复使用

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