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第2节 基因工程的基本操作程序
本节聚焦:
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
第三章 基因工程
（第二课时）
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
温故知新：PCR扩增目的基因的过程
问题:获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
不能原因
那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？
合作探究一：请同学们自主阅读教材P80，小组合作思考讨论完成问题。
第二步：基因表达载体的构建
1.基因表达载体的构建的目的？载体还需要哪些结构？各个元件有什么作用？
2.目的基因插入什么位置？目的基因插入位点是随意的吗？
3.请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。
4.使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？如果不能，怎么改进？
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
知识拓展：基因结构：
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
（一）目的：
①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;
（二）组成：
质粒
①启动子
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA
②终止子：
限制酶切割位点
基因的尾端，能终止mRNA的转录
③标记基因
④复制原点
⑤目的基因
②使目的基因能够表达和发挥作用
问题: 目的基因该插入什么位置？
基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞
DNA复制所需结构
（二）组成：
基因工程的核心
问题:目的基因该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
诱导型启动子：
第二步：基因表达载体的构建
基因工程的核心
辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”。
（二）组成：
第二步：基因表达载体的构建
启动(终止)转录
启动(终止)翻译
作用
位于DNA上
位于mRNA上
位置
DNA片段
三个相邻碱基
本质
启动(终止)子
启始(终止)密码子
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
DNA
连接酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
限制酶切割位点
质粒
重组
DNA分子
限制酶
限制酶
基因工程的核心
（三）过程：
第二步：基因表达载体的构建
第二步：基因表达载体的构建
基因工程的核心
问题探讨：
1、使用一种限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
活动一：基因表达载体的构建
用Ecol RⅠ限制酶（识别GAATTC，切割GA之间）切割载体和目的基因。
目的基因能否自连？质粒能否自连？目的基因与质粒能否反向连接？
问题探讨: 1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
单酶切缺点：
①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接
第二步：基因表达载体的构建
基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
基因工程的核心
2、如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
问题探讨：
活动二：基因表达载体的构建
用Ecol RⅠ（识别GAATTC，切割GA之间）和BglⅡ限制酶（识别AGATCT，切割AG之间），切割载体和目的基因，并将其连接。
双酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和载体切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
【情境】目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为　　　　　　　　　　　　。
(2)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　
　。
(3)构建基因表达载体时,可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA,但会导致
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　等问题,为避免以上问题出现,应使用 　　 　　　　　　　　　 两种限制酶。
SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因
目的基因自身环化、目的基因不能定向连接
BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)
限制酶和DNA连接酶
任务二　基因表达载体的构建
【情境】目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
任务二　基因表达载体的构建
(4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上　 　,其是　　 　识别和结合的部位。
(5)请简要描述基因表达载体的构建过程。

RNA聚合酶
用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段,产生末端相同的切口,再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
启动子
1.目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为　　　　　　　　　　　　。
(2)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　
　。
(3)构建基因表达载体时,可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA,但会导致
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　等问题,为避免以上问题出现,应使
用 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 两种限制酶。
SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因
目的基因自身环化、目的基因不能定向连接
BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)
限制酶和DNA连接酶
(4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上　 　　,其是　　　　　　识别和结合的部位。
RNA聚合酶
启动子
　实战训练　
　实战训练　
2.某目基因两侧的 DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示,下列可作该目的基因最佳载体的是 (　　)
　　　　　　　　
A　　　　 B C　　　　　　 　D
　实战训练　
3.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是(　　)
A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码
B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用
C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选
D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
　实战训练　
4.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ ）
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸
B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因
等组件
C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因
的表达
D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
　实战训练　
5.图甲、图乙分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是(　　)
A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用Sma Ⅰ切割
B.图甲所示的质粒分子在经Sma Ⅰ酶切割后含有4个游离的磷酸基团
C.为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶
D.用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和Bam HⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以
6. 在基因表达载体的构建中,下列说法正确的是 (　　)
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
⑤必须在细胞外进行
A.②③⑤ B.①④ C.①②⑤ D.③④
A
　实战训练　
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
合作探究二：请同学们自主阅读教材P81，小组合作思考讨论完成问题。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？各自适用于什么生物？
2.农杆菌的特点？农杆菌转化法的原理。
3.请文字和箭头表示农杆菌转化法的过程。
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？各自适用于什么生物？
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
目的基因
目的基因
适用生物：开花植物
（一）方法：
1.将目的基因导入植物细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
（一）方法：
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
①农杆菌特点：
第三步：将目的基因导入受体细胞
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
③过程：
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.农杆菌转化法
一
将目的基因导入植物细胞
两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
2.将目的基因导入动物细胞
（1）显微注射法
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）
获得具有新性状的动物
①体积大，易操作；
②全能性高，易培养成完整个体。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1、常用方法：
Ca2+处理
原核细胞（常选择大肠杆菌）
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
3、过程：
2、受体细胞：
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
吸收
Ca2+
感受态细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
基因工程第四步：目的基因的检测与鉴定
讨论：请大家回顾基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR技术，DNA分子杂交技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
（一）目的：
（二）检测内容及方法：
第四步：目的基因的检测与鉴定
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
第四步：目的基因的检测与鉴定
（二）检测内容及方法：
（1）基因是否插入染色体DNA
1.分子水平的检测
（二）检测内容及方法：
（1）基因是否插入染色体DNA
方法1：PCR技术
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
1.分子水平的检测
第四步：目的基因的检测与鉴定
转基因生
物的DNA
探针
15N
变性
变性
15N
思考：DNA分子杂交检测目的基因的原理是什么？
碱基互补配对原则
杂交DNA分子（可检测）
第四步：目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
方法：PCR扩增和分子杂交技术
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液。或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
第四步：目的基因的检测与鉴定
（二）检测内容及方法：
（2）目的基因是否转录
1.分子水平的检测
（二）检测内容及方法：
PCR技术
（2）目的基因是否转录
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
1.分子水平的检测
第四步：目的基因的检测与鉴定
（二）检测内容及方法：
（3）目的基因是否翻译
方法：抗原-抗体杂交技术
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
脱分化
苏云金杆菌
1.分子水平的检测
第四步：目的基因的检测与鉴定
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
个体水平：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
第四步：目的基因的检测与鉴定
（二）检测内容及方法：
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
课堂小结
前提
核心
关键
保证
利用PCR获取和扩增
目的基因、启动子、终止子、标记基因
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物);
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
练习与应用（P83）
一.概念检测
D
2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
练习与应用（P83）
二、拓展应用
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是______ ，标记基因是_____ ，质粒pSYN12424的作用是______ 。
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
不能。限制酶可能将它切断。
　实战训练　
1.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达
A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C.提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
　实战训练　
2.科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如图)。下列相关叙述错误的是（ ）
A.过程①合成人生长激素基因的过程
需要用到逆转录酶
B.过程③是将重组质粒溶于缓冲液后
与经Ca2＋处理的细菌B混合
C.成功导入了重组质粒的细菌B在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长
D.可采用抗原—抗体杂交技术检测工程菌中生长激素基因是否成功表达
　实战训练　
3.目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是(　　)A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNAB．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
　实战训练　
4．菊花是一种双子叶植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长，还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长。某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述错误的是(　　)A．受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞B．将目的基因GNA插入到Ti质粒的T DNA上构建表达载体C．菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞D．应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
　实战训练　
5.下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为抗氨苄青霉素基因）。下列叙述错误的是（　　）
A．④过程中可利用目的基因作为探针对植株进行筛选
B．可同时选用限制酶PstI、SmaI对含目的基因的DNA进行剪切
C．过程②可采用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞
D．质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达
　实战训练　
6.新冠病毒是一种单链RNA病毒，用“荧光RT PCR技术”进行检测，方法是取检测者的mRNA逆转录出cDNA，并大量扩增，用荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含有新冠病毒的cDNA。在检测过程中，得到一条荧光强度的变化曲线，如图所示(根据超过阈值时Cycle的次数确定是否是新冠确诊病例)。下列说法错误的是
(　　)
A．“荧光RT PCR技术”中遵循的碱基配对原则与转录过程不完全一致B．若a点左移，则说明检测样本中的新冠病毒含量较高C．“平台期”出现是受限于荧光探针、引物、及原料的数量D．样本经“荧光RT PCR技术”扩增后，只要超过阈值即为新冠确诊病例
　实战训练　
7.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
　实战训练　
A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
8.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是
　实战训练　
9.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（ ）
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中；
②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；
③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养
④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。
A.①② B.③④ C.②③ D.①④
　实战训练　
10.科研人员以抗四环素基因为标记基因,通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白,治疗鼠的镰状细胞贫血。下列相关实验设计中,不合理的是(　　)
A.构建的表达载体除了目的基因外,还需要启动子、终止子、复制原点、标记基因
B.用含有四环素的培养基可以筛选出已经导入目的基因的大肠杆菌
C.小鼠的β-珠蛋白基因可以直接转给大肠杆菌进行表达得到 β-珠蛋白
D.用Ca2+处理大肠杆菌后,表达载体易于导入大肠杆菌中
问题: 将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？

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