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(共35张PPT)
第三章 基因工程
第2节
基因工程的基本操作程序
抗虫棉的培育过程
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
操作程序
01
04
03
02
目的基因的筛选与获取
01
目的基因的筛选与获取
目的基因
（1）概念
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要指的是编码蛋白质的基因
（2）常见类型
① 与生物抗逆性相关基因
② 优良品质相关基因
③ 生产药物相关基因
④ 毒物降解相关基因
⑤ 工业用酶相关基因
如何筛选目的基因？
目的基因的筛选
（1）方法
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选
（2）实例
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
Bt基因的表达产物--Bt抗虫蛋白在起作用
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
目的基因的获取
（1）从基因文库中获取
（2）通过DNA合成仪直接合成
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
基因文库
与载体连接
导入受体菌群
限制酶切割
提取某生物
全部DNA
许多DNA片段
该生物基因组文库
mRNA
逆转录酶
杂交双链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链cDNA
与载体连接
导入受体菌群
该生物cDNA文库
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子
cDNA文库中的基因不含以上结构
人工合成目的基因
（1）前提
（2）方法
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR的概念
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
①全称：
②原理：
③操作环境：
④目的：
⑤优点：
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
DNA在体内的半保留复制
① 条件：模板 、原料、能量、酶
② 模板：DNA的两条链（母链）
③ 原料：四种游离的脱氧核苷酸
④ 能量：一般由ATP水解供能
⑤ 酶：解旋酶、DNA聚合酶
⑥ 特点：半保留复制、边解旋边复制
（2）PCR的前提
一段已知目的基因的核苷酸序列
（3）PCR的原料
① 模板DNA ② DNA引物
③ 四种脱氧核苷酸 ④ 耐高温的DNA聚合酶
⑤ 缓冲液
（4）PCR的特点
以指数方式扩增
引物设计原则：
1、长度适当（20-30bp）
2、引物内部不发生碱基互补配对
3、引物之间不发生碱基互补配对
（5）PCR反应的过程
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次
DNA总数 21 22 23 24 2n
长-中链DNA
中-短链DNA
短-短DNA
含引物A(或B) 的DNA
共消耗的 引物数量
2
2
2
2
2
0
2
4
6
2n - 2
0
0
2
8
2n - 2n
1
3
7
15
2n -1
2
6
14
30
2n+1 -2
（5）对PCR产物进行鉴定
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 主要在细胞核内
方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制
起始位点 引物3'端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶（Taq酶） 解旋酶、DNA聚合酶等
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 DNA在高温下变性解旋 解旋酶解旋
引物 DNA片段，保留在复制的子链中 RNA片段，不保留在复制的子链中
产物 扩增特定的DNA片段或基因 合成整个DNA分子
循环次数 PCR一般要经历30次循环 与细胞分裂同步
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
02
基因表达载体的构建
基因的结构
（1）原核生物基因
非编码区
非编码区
启动子
编码区
终止子
非编码区位置：编码区上游与编码区下游
非编码区功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号
终止子：终止RNA的合成
编码区：编码蛋白质的合成
1
2
3
4
5
启动子
终止子
（2）真核生物基因
不能编码蛋白质的序列 = 内含子 + 非编码区序列
编码序列 = 外显子
前体mRNA 、mRNA
为什么不直接将目的基因导入受体细胞？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解；就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
① 将基因送入受体细胞中并能够复制
② 使目的基因在受体细胞内能够表达和发挥作用
构建基因表达载体的目的：
用于构建基因表达载体的质粒（人工改造）
有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达
基因表达载体的相关组件
① 复制原点
② 启动子
③ 终止子
④ 标记基因
⑤ 目的基因
基因表达载体≠载体
控制特定性状或表达特定产物
功能：它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止
目的基因
启动子
位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点
功能：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA（基因转录的开始）
终止子
位置：基因的下游
标记基因：检测目的基因是否导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞。
(一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因)
复制原点：DNA聚合酶结合位点，使目的基因复制和传递
是一段有特殊序列结构的DNA片段
是一段有特殊序列结构的DNA片段
启动子、终止子和起始密码子、终止密码子的区别
起始（终止）密码子 启动（终止）子
本质 三个相邻碱基 DNA片段
位置 位于RNA上 位于DNA上
作用 启动（终止）翻译 启动（终止）转录
基因表达载体构建的过程
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
1’
1
2’
使用一种DNA限制酶进行切割，后续连接情况
单酶切缺点
① 质粒重新环化
② 目的基因自身环化
③ 质粒与目的基因反向连接
双酶切的优点
① 防止质粒重新环化
② 防止质粒与目的基因反向连接
③ 防止目的基因自身环化
PstⅠ 和 EcoRⅠ
课后作业：
1、记背相关知识点
2、课时练大本
3、课时练小本(共26张PPT)
第三章 基因工程
第2节
基因工程的基本操作程序
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
操作程序
01
04
03
02
目的基因的筛选与获取
01
目的基因导入受体细胞
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
农杆菌转化法（常用）
花粉管通道法
—— 显微注射法
—— Ca2+处理法
目的基因
导入
花粉管通道法（开花植物）
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
农杆菌转化法
转化：
特点：
T-DNA的特点：
目的基因插入位置：
农杆菌转化法
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
两次拼接：
① 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
② 第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T -DNA
拼接到受体细胞的染色体DNA上
两次导入：
① 将含有目的基因的Ti质粒导入农杆菌
② 含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
显微注射法
受体细胞:
原因：
受精卵
① 体积大，易操作
② 易表现出全能性
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
目的基因导入微生物细胞
（1）常用方法：Ca2+处理
目的：使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
（2）受体细胞：原核细胞（常选择大肠杆菌）
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养
为了改变受体细胞性状？为了获得预期表达产物？
利用转基因大肠杆菌生产药物的实验思路
02
目的基因的检测与鉴定
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
类型 检测内容 方法
分子水平上的检测 目的基因是否导入
目的基因是否转录 目的基因是否表达
个体水平上的鉴定 个体是否具有相应性状
PCR技术、
分子杂交技术
抗原-抗体杂交技术
抗虫鉴定、抗病鉴定等
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
PCR技术检测目的基因
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
PCR技术检测目的基因转录的mRNA
DNA分子杂交流程图
观察是否有杂交带
RNA分子杂交流程图
观察是否有杂交带
抗原-抗体杂交技术
观察是否有杂交带
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
抗虫鉴定、抗病鉴定
接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐碱植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）接种实验
一定浓度的盐水浇灌
喷洒除草剂
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
害虫死亡
未染病
正常生长
正常生长
功能、活性正常
1、将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是_______；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为_________。该方法中农杆菌的作用是_____________________
_________________________________。
Ti质粒
T－DNA
感染烟草细胞，把目的
基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
2、在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是__________________________________________________________________
防止目的基因自连、质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率
3、含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。为什么？
____________________________________________________________________
否
含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
课后作业：
1、记背相关知识点
2、课时练大本
3、课时练小本(共13张PPT)
第三章 基因工程
第2节
基因工程的基本操作程序
01
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1、DNA体外扩增的原理
① PCR利用了DNA热变性的原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合
② PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环
2、DNA片段电泳鉴定的原理
① DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳
② 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关
③ 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来
3、材料仪器
PCR仪
微量离心管
微量移液器
电泳装置
4、实验材料
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物
耐高温的DNA聚合酶、模板DNA
扩增缓冲液、无菌水
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液
琼脂糖、核酸染料等
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
5、实验步骤
加样
离心
扩增
配置琼脂糖溶液
制备凝胶
电泳加样
电泳、观察
6、注意事项
① PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
② 缓冲液和酶使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化
③ 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
④ 在进行操作时，一定要戴好一次性手套
⑤ PCR扩增不能随意加大试剂用量
你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp
你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等
课后作业：
1、记背相关知识点
2、课时练大本
3、课时练小本

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