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第2章 细胞工程
2.2.2 动物细胞工程
学习目标
动物细胞融合技术的概念，常用方法
单克隆抗体的制备过程及应用
移栽
移栽后的植株
愈伤组织
A细胞
B细胞
纤维素酶果胶酶
①去壁：
酶解法
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
②诱融
物理法：
化学法：
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+ —高pH融合法等
脱分化
再分化
A原生质体
B原生质体
植物组织培养
（植物细胞的全能性）
（细胞膜的流动性）
杂种细胞
灭活病毒只能诱导动物细胞融合
形成杂种细胞的标志
体细胞杂交完成的标志
杂种植株
植物细胞融合
植物体细胞杂交
【重温】植物体细胞杂交的过程
【重温】植物体细胞杂交的过程
那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？
意义：
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育了植物新品种
【重温】必修一：细胞膜的结构
融合细胞
细胞
融合
37℃
40min
正在融合的细胞
红色荧光染料标记膜蛋白
绿色荧光染料标记膜蛋白
人细胞
小鼠细胞
1970年，动物细胞融合实验
动物细胞融合技术
课本P48
1.概念：
2.原理：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术
细胞膜具有一定的流动性
融合形成杂交细胞
(具有原来两个或多个细胞的遗传信息的单核细胞)
PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等
（化学法 物理法 生物法）
动物细胞融合特有
4.结果：
5.意义：
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
3.融合方法：
动物细胞融合技术
【思考】为什么灭活的病毒仅能诱导动物细胞融合而不致病？其机理是什么？
机理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
灭活：用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，
但并不破坏它们的抗原结构
失去感染性保留抗原性
动物细胞融合完成的标志？
细胞核的融合
动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性
植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
物理(电融合法、离心法)
化学(聚乙二醇融合法、
高Ca2+-高pH融合法)
物理(电融合法）
化学(聚乙二醇(PEG)融合法)
生物方法：灭活的病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
大本P39
练习
（1）与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒 （　 　）
（2）灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构 （　　 ）
（3）二倍体动物体细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
四倍体细胞
传统抗体制备方法及缺陷
抗原
免疫过程
传统抗体
多种混合
向动物体内反复注射某种抗原
从动物血清中分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
（2）缺点：
（1）方法：
课本P49
如何解决这个问题呢？
如何获得大量、单一的抗体？
1.大量制备单一抗体的思路和需解决的问题
2.什么细胞能直接在体外无限增殖？
癌细胞能在体外大量增殖
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
B淋巴细胞群
克隆
遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的
因为B淋巴细胞已经分化，所以增殖能力弱
3.有什么办法能得到既能迅速大量增殖又能产生大量特定抗体的细胞呢？
（癌细胞不能产生抗体）
单一B淋巴细胞
选择
大量纯度高特异性强的抗体
产生
单克隆抗体的制备
课本P49
单
克 隆
抗 体
4.单克隆抗体制备思路
一种B淋巴细胞
（只能产生一种特定抗体）
骨髓瘤细胞
（能大量增殖）
杂交瘤细胞
既能产生抗体
又能大量增殖
大量的特定抗体
动物细胞融合
动物细胞培养
英国：米尔斯坦
德国：科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
单克隆抗体的制备
课本P49
单克隆抗体的制备过程
课本P48-49
多次注射特定的抗原进行免疫
多种B淋巴细胞
从脾中提取
能产生抗体，
但不能大量增殖
1.为什么要注射抗原？
为了获得特定的B淋巴细胞
2.那为什么得的是多种B淋巴细胞呢？
因为一种B细胞只能产生一种特定的抗体，小鼠的脾中分离出来的B细胞，还包含了其他抗原激活的B淋巴细胞
单克隆抗体的制备过程
课本P48-49
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
多次注射特定的抗原进行免疫
多种B淋巴细胞
从脾中提取
能产生抗体，
但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
培养骨髓瘤细胞
单克隆抗体的制备过程
课本P48-49
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
多种杂交细胞
若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？
B-B细胞
B-瘤细胞
瘤-瘤细胞
3种
杂交瘤细胞
诱导融合
杂交瘤细胞
单克隆抗体的制备过程
课本P48-49
多种杂交细胞
第一次筛选
用特定的选择培养基 (HAT培养基)
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
(目的：筛选获得杂交瘤细胞)
特点：既能迅速大量增殖，又能产生抗体
杂交瘤细胞
特点：既能迅速大量增殖，又能产生抗体
单克隆抗体的制备过程
课本P48-49
第二次筛选
克隆化培养、抗体检测
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
(经多次筛选)
(目的：筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞)
方法：抗原—抗体杂交
原理：抗原—抗体特异性结合
克隆化培养、抗体检测？
课本P49
多孔细胞培养板
用培养液稀释
第二次筛选目的：
筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
抗体检测
方法：抗原—抗体杂交
原理：抗原—抗体特异性结合
多孔细胞培养板
96孔板
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
①将杂交瘤细胞用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。
②然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
③阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续稀释培养，一般经过3~4次培养才可以获得稳定的单克隆细胞，这时候，如果再次检测抗体为阳性，就可以进行大规模生产了。
克隆化培养、抗体检测？
课本P49
抗体检测
方法：抗原—抗体杂交
原理：抗原—抗体特异性结合
注射到小鼠腹腔内
单克隆抗体的制备过程
课本P48-49
单克隆抗体
体外培养
从细胞培养液中提取
从小鼠腹水中提取
体内培养
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
特点：特异性强、灵敏度高、可大量制备
应用到的技术？
原理？
细胞膜具有一定的流动性
多种杂交细胞及未融合的细胞
小鼠骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
给小鼠注射特定抗原
诱导 融合
提取
第一次筛选
用特定的选择性培养基
第二次筛选
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔
体外培养
大量单克隆抗体
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（能产生抗体）
（能无限增殖）
从腹水中提取
从培养液中提取
克隆化培养、抗体检测
（进行多次筛选）
动物细胞融合
动物细胞培养
细胞增殖
单克隆抗体制备过程
特点：特异性强、灵敏度高、可大量制备
若用a表示骨髓瘤细胞，b表示B淋巴细胞，则单克隆抗体制备过程中的两次筛选可表示为( )
练习
选项 筛选前 第一次筛选获得 第二次筛选获得
A a、aa、ab、bb、b a、aa、ab ab
B a、aa、ab、bb、b ab、bb、b ab
C a、aa、ab、bb、b ab 能无限增殖的ab
D a、aa、ab、bb、b ab 能产生特定抗体的ab
D
【典例】（2020年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅰ)）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：
（1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是___________________________________________________。
（2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_______________________________________________________________________________。
诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞
取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液
（3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于____________，使用该培养基进行细胞培养的结果是__________________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是_________________________________。
（4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有_______________________________________________________________（答出2点即可）。
选择培养基
只有杂交瘤细胞能够生存
抗原-抗体特异性结合
将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体：
比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。
单克隆抗体的应用
课本P50
1.广泛用作诊断试剂
抗原-抗体杂交法
具有准确、高效、简易、快速特点
单克隆抗体作为诊断试剂的优点：
原理：抗原—抗体特异性结合
新冠病毒抗原检测试剂盒
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病
可用于多种疾病的诊断、病原体的鉴定
单克隆抗体的应用
课本P50
1.广泛用作诊断试剂
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
新冠病毒抗原检测试剂盒
单克隆抗体的应用
课本P50
【资料2】使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。
抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
单克隆抗体的应用
课本P50
思考：ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体：主要发挥靶向运输作用
即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞
药物：发挥治疗效应，如杀伤靶细胞
单克隆抗体的应用
课本P50
2.运载药物：
如抗体-药物偶联物（ADC）
3.直接用于治疗疾病
在医学领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位
能特异性识别肿瘤抗原的
发挥杀伤作用的为：________________
单克隆抗体的作用：________________
药物
靶向运输的作用
通过将药物与 单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
(1)原理：
位置准确(靶向清楚)、疗效高、副作用小(不会对自身健康细胞造成伤害）
(2)优点：
1.广泛用作诊断试剂
练习
（1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞（　 　）
（2）单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同（ 　　）
（3）ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用（　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
练习
人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，人工制备的抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。回答下列问题：
（1）制备单克隆抗体过程中要用到_______________和________________技术。制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的HCG相当于________，使小鼠产生能分泌相应抗体的浆细胞。
（2）最终筛选获得的杂交瘤细胞具有______________________________的特点。利用杂交瘤细胞生产的单克隆抗体可以与_________________________________特异性结合，从而诊断早孕。
动物细胞融合
动物细胞培养
抗原
能无限增殖并分泌所需抗体
人绒毛膜促性腺激素(或HCG）
拓展：第一次筛选原理
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤(物质A)阻断
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但可以不断分裂增殖
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
(假设为C)
合成DNA
D途径
S途径
D途径
培养基中加入物质A
C、B、CC、BB、CB1、CB2、CB3
筛选出杂交瘤细胞方法？
培养基中加入物质A(氨基嘌呤)
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
D途径被阻断，无法增殖死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤(物质A)阻断
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但可以不断分裂增殖
拓展：第一次筛选原理
如图，核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径。正常细抱内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶。制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞缺乏转化酶。现用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”筛选出杂交细胞。下列有关筛选原理的叙述，正确的是( )
练习
B
A.免疫的B淋巴细胞及其相互融合细胞因全合成途径被A阻断，在HAT培养基上不能增殖
B.骨髓瘤细胞及其相互融合细胞因无法进行上述两个途径，而在HAT培养基上不能增殖
C.杂交瘤细胞因为可进行上述两个途径，能在HAT培养基上大量增殖
D.HAT培养基上筛选出的所有杂交瘤细胞，既能大量增殖又能产生较高纯度的目标抗体
【网络构建】
练习
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
C
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
科研人员将抗癌药物连接在单克隆抗体上制成“生物导弹”用于癌症治疗。“生物导弹”由两部分组成，一是“瞄准装置”，二是“杀伤性弹头”。分析下列有关描述，其中不正确的是
A.“瞄准装置”由识别肿瘤的单克隆抗体组成
B.“弹头”由放射性同位素、化学药物或毒素等物质构成
C.“弹头”中的药物有选择杀伤肿瘤细胞的功能
D.“生物导弹”的制备应用了细胞工程
练习
C
练习
抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列表述正确的是（ ）
A．ADC可通过主动运输进入肿瘤细胞
B．抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡
C．单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合
D．肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，所以不会产生新的蛋白质
C
ADC进入细胞后被溶酶体裂解，释放药物，导致细胞凋亡
(2022·北京海淀高二期中)为降低乳腺癌治疗药物的副作用，科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体—药物偶联物(ADC)，过程如图1所示。请回答下列问题：
(1)本实验中，小鼠注射的特定抗原应取自_______________。
(2)步骤①常用方法包括_____融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。
人的乳腺癌细胞
PEG
(3)步骤②的细胞必须经过步骤③克隆化培养和__________才能筛选得到符合要求的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞的特点是__________________________________。杂交瘤细胞可采用注射到小鼠腹腔内培养或进行_____培养的方式进行扩大培养。
抗体检测
既能大量增殖，又能产生特定抗体
体外
(4)步骤④是将获得的a____________和b__________________这2部分，通过接头结合在一起，从而获得ADC。
单克隆抗体
治疗乳腺癌的药物
(5)研究发现，ADC在患者体内的作用如图2所示。
①ADC能降低乳腺癌治疗药物的副作用，是因为____________能精确地定位乳腺癌细胞，该过程依赖于_____________________反应。
②ADC进入乳腺癌细胞后，细胞中的溶酶体可将其______，释放出的药物最终作用于_______，可导致癌细胞凋亡。
单克隆抗体
特异性的抗原—抗体
水解
细胞核
(2022·广西南宁高二阶段练习)如图是一种“生物导弹”的作用原理示意图，没有与肿瘤细胞结合的“生物导弹”一段时间后被机体清除。阿霉素是一种抗肿瘤药，可抑制DNA和RNA的合成，对正常细胞也有一定毒性。下列说法不正确的是
A.单克隆抗体是由杂交瘤细胞合成和
分泌的
B.活化阿霉素能抑制细胞中的DNA复
制和转录过程
C.在治疗中，应先注射非活化磷酸阿霉素再注射生物导弹
D.单克隆抗体特异性强，能减轻阿霉素对正常细胞的伤害
练习
C
应先注射生物导弹再注射非活化磷酸阳霉素，但不能间隔时间太长，因为没有与肿瘤细胞结合的生物导弹”一段时间后被机体清除

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