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回顾
重组DNA技术的基本工具？
限制酶的来源？本质？作用？作用的化学键？结果？
DNA连接酶的本质？作用？作用的化学键？种类？
载体的种类？作为载体需要的条件？
什么是质粒？
DNA粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤
第3章 基因工程
3.2 基因工程的基本操作程序
学习目标
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些
从社会中来
课本P76、76
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(Bt 抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫(P76)
①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
P77 [相关信息]
你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
培育转基因抗虫棉的简要过程
课本P76
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
导入
与载体拼接
抗虫基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
课本P76
将目的基因导入受体细胞
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达
（核心）
知识补充：基因结构
基因1 基因2 基因3
基因通常是有遗传效应的DNA片段
DNA片段
内含子
外显子
非编码区
编码区
启动子
终止子
真核生物基因
放大
启动子
终止子
原核生物基因
非编码区
非编码区
编码区
非编码区
知识补充：基因结构
内含子
外显子
启动子
终止子
不间隔的、连续的
非编码区
非编码区
编码区
启动子
终止子
(2)真核生物基因
(1)原核生物基因
非编码区
非编码区
编码区
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录
转录
前体mRNA
成熟mRNA
剪切、拼接
间隔的、不连续的
编码蛋白质的合成
不转录，不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
编码区:
非编码区:
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
终止转录
真核生物的基因：
起始密码子和终止密码子？
不能编码蛋白质的序列
=非编码区+内含子
能编码蛋白质的序列
=外显子
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因上游
也是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因下游
终止转录
本质：
位置：
作用：
本质：
位置：
作用：
能转录相应的mRNA，
能转录相应的mRNA，
外显子:
内含子:
进一步能编码蛋白质的DNA序列
但却不能编码蛋白质的DNA序列
知识补充：基因结构
编码区：
非编码区：
原核基因
真核基因
编码区
非编码区：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，不能编码蛋白质的DNA序列，
然后在翻译前就被剪切掉
能转录相应的mRNA，进一步能编码出蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
mRNA
基因的一条链
知识补充：基因结构
(1)原核生物基因
科学工作者分离得到子某原核生物基因，并将其解离成两条单链
现让其中一条链与由该基因转录而来的mRNA杂交配对，结果如图所示
基因的编码区
基因的
非编码区
基因的
非编码区
基因的一条链
成熟mRNA
基因的编码区
基因的
非编码区
基因的
非编码区
(2)真核生物基因
科学工作者分离得到子某真核生物基因，并将其解离成两条单链
现让其中一条链与由该基因转录而来的mRNA杂交配对，结果如图所示
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不能编码蛋白质的序列
=非编码区
原核生物的基因：
不能编码蛋白质的序列
真核生物的基因：
=非编码区+内含子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
知识补充：基因结构
练习
下列有关基因结构的叙述，正确的是
A.真核细胞的基因中，编码区也含有不能编码蛋白质的碱基序列，叫外显子
B.原核细胞的基因中，编码区的外显子是连续的
C.无论是真核还是原核生物，能编码蛋白质合成的序列均位于编码区
D.终止密码子是转录终止的信号，阻碍RNA聚合酶的移动
C
真核生物的基因结构:包括编码区和非编码区
(编码区又分为内含子和外显子，内含子转录后被剪切掉)
原核生物的基因结构:包括编码区和非编码区
(编码区无内含子和外显子之分，是连续的)
终止密码子位于mRNA上，作用是终止翻译的过程，而RNA聚合酶则是用于转录的酶
【思考】真核细胞基因编码区中的内含子不编码蛋白质，但表达时是否转录？
内含子
外显子
非编码区
非编码区
编码区
启动子
终止子
1
2
3
4
转录
前体mRNA
1
2
3
4
成熟mRNA
剪切(内含子转录而来的序列)、拼接
1
2
3
4
【思考】从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是：
胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列无法被切除，无法表达出胰岛素
知识补充：基因结构
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
课本P76
定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(Bt 抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因--Bt抗虫蛋白基因(Bt基因)
1.目的基因
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
课本P76
2 筛选合适的目的基因
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
(1)较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
课本P77
(2)认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库(GenBank)、序列比对工具(如BLAST)等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
2 筛选合适的目的基因
(1)较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
课本P77
目的基因获取方法
利用PCR获取和扩增目的基因
从基因文库中获取
通过人工合成
3 获取目的基因的方法
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
课本P77
3 获取目的基因的方法
(1)人工合成目的基因
DNA合成仪
①前提：基因比较小、核苷酸序列已知
②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
3 获取目的基因的方法
(2)从基因文库中直接获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库
(主要指cDNA文库)
基因文库
基因组文库
部分基因文库
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
3 获取目的基因的方法
(2)从基因文库中直接获取
①建立基因组文库：包含某种生物全部基因
某生物所有DNA
特定的限制酶
基因组所有基因
每个基因和载体结合重组DNA分子
基因组文库
导入受体菌
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
3 获取目的基因的方法
(2)从基因文库中直接获取
②建立cDNA基因文库：只包含某种生物部分基因
某种生物的成熟mRNA
与mRNA互补的单链DNA
逆转录酶
双链DNA片段
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
cDNA：经逆转录后与RNA互补的DNA
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
3 获取目的基因的方法
(2)从基因文库中直接获取
部分基因文库和基因组文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子(非编码区)
基因中内含子
基因多少
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
使用cDNA文库获得目的基因更加高效,除去了不能编码蛋白质的序列(如非编码区、内含子)
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
3 获取目的基因的方法
★(3)利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人（先入为主）于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
PCR技术：
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
3 获取目的基因的方法
★(3)利用PCR获取和扩增目的基因
PCR是_______________的缩写，是一项根据________________
的原理，在_____提供参与DNA复制的_________与_________，对______________________进行_________的技术
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
原理
操作环境
目的
全称
PCR扩增仪
课本P77
【重温】DNA体内复制的过程及条件
合成子链
解旋
形成新DNA
参与的组分 在DNA复制中的作用
DNA母链
4种脱氧核苷酸
解旋酶
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
3′
5′
DNA的合成方向：
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
子链
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链
原因：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端
子链合成需要引物：
从子链的5 ′端向3 ′端延伸
【重温】DNA体内复制的过程及条件
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
引物：
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链
·细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物
·细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物
用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸
引物结合在模板链的3’端
参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端
开始连接脱氧核苷酸
缓冲液（含Mg2+）
DNA母链
4种脱氧核苷酸
90℃以上高温
耐高温的DNA聚合酶
引物
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
（2种）
不同的温度：变性、复性和延伸需要不同温度
（Taq 酶）
PCR技术
课本P77-79
1.DNA体外复制（PCR）的条件
2.PCR反应过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
PCR技术
课本P77-79
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物
第二轮循环的产物
第三轮循环的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
2.PCR反应过程
PCR技术
课本P77-79
目的基因DNA__________后__________，______与单链相应互补序列结合；然后以___________为模板在____________作用下进行_____，即将4种____________加到______________，如此重复循环多次。
过程归纳：
受热变性
解为单链
引物
延伸
单链DNA
DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，即成_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
2.PCR反应过程
PCR技术
课本P77-78
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式
场所
酶
温度
结果
联系 解旋酶催化
主要在细胞核内
解旋酶、DNA聚合酶等
细胞内温和条件
合成整个DNA分子
①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板
②原料：均为四种脱氧核苷酸
③酶：均需DNA聚合酶
④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
DNA在高温下变性解旋
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）
控制温度，需在不同温度下进行
扩增特定的DNA片段或基因
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可提供合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量
脱氧核苷三磷酸
PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供，无需添加ATP
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
★利用PCR获取和扩增目的基因
P77-79
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？
第三次循环
第一轮循环
第二轮循环
第三轮循环
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
非目的基因序列
目的基因序列
引物
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
★利用PCR获取和扩增目的基因
P77-79
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数
含引物的DNA分子数
DNA链数目
共消耗引物的个数
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数
2
2
2
0
4
4
6
0
8
8
14
2
2n
2n
2n+1-2
2n-2n
呈指数形式扩增（ n次扩增循环后，DNA数量约为2n）
PCR结果：
4
8
16
2n+1
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
★利用PCR获取和扩增目的基因
P77-79
①n代后，DNA分子有_____个 ②n代后，含引物的DNA分子有_____个
③n代后，共消耗________个引物 ④n代后，完整的目的基因有_______个
⑤n代后，DNA链有_______条 ⑥第n代复制，消耗了______个引物
⑦第____次循环产物出现完整的目的基因
2n
2n+1
3
2n
2n+1-2
2n
2n-2n
呈指数形式扩增（ n次扩增循环后，DNA数量约为2n）
PCR结果：
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
★利用PCR获取和扩增目的基因
设计引物的要求：
①引物自身不能有互补序列
②引物之间不能有互补序列
③引物长度要适宜
④引物能与目的基因两侧特异性结合
……
防止引物自身互补折叠
防止两引物之间配对，导致引物不能各自同模板链结合
【拓展】设计引物的注意事项
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
★利用PCR获取和扩增目的基因
设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
【拓展】设计引物的注意事项
基因工程的基本操作程序 | 第1步 目的基因的筛选与获取
★利用PCR获取和扩增目的基因
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增
（逆转录PCR，简称RT-PCR ）
①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子
②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA
③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，
形成双链DNA分子，即cDNA
练习
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （　 　）
(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （　 　）
(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （　 　）
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高 （　 ）
(5)PCR扩增过程中，需要添加ATP为新链合成提供能量（ ）
(6)PCR扩增过程中，通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过程提供能量（ ）
判断常考语句，澄清易混易错
温度不能为变性、复性和延伸等过程提供能量
PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供
练习
下列属于PCR技术所需条件的是（ ）
①单链的核苷酸序列引物　②目的基因所在的DNA片段
③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　⑥DNA聚合酶　⑦限制酶
A.①②③⑤ B.①②③⑥ C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦
B
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
P80
获得了足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？
①游离的DNA进入细胞后，一般会直接被分解。
②就算没有被破坏且能进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着细胞分裂进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
核心工作——基因表达载体构建
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
1.基因表达载体构建的目的
①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
2.基因表达载体的组成
②同时使目的基因能够表达和发挥作用
P80
作为基因表达载体，除了目的基因外，还需要哪些元件呢？
启动子：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
终止子：
使转录在所需要的地方停下来
初步筛选出有目的基因的受体细胞。常用的标记基因有抗性基因（如抗生素抗性基因）、荧光蛋白基因等
(质粒复制所需结构，带动目的基因复制)
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
P80
(2)终止子
①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段
②位置：位于基因的下游
③功能：使转录在所需要的地方停下来
2.基因表达载体的组成
①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段
②位置：位于基因的上游
③特殊类型：诱导型启动子、组成型启动子
A.诱导型启动子：受环境因素影响，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达
B.组成型启动子：不受环境因素影响，不需其他因子诱导可以稳定表达
(1)启动子
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
2.基因表达载体的组成
P80
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
启动子：
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
复制原点：
质粒复制所需结构，带动目的基因复制
终止子：
位置：基因的下游
功能：终止转录
标记基因：便于重组DNA分子的筛选
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
P80
3.基因表达载体构建过程
如何构建抗虫棉的基因表达载体？
两种工具酶分别是？
① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口
② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
③ 将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子
载体
基因表达载体
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
P80
3.基因表达载体构建过程
结合图示，概述基因表达载体构建的流程：
①用限制酶切割载体，使它出现一个切口
③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体切口处，形成重组DNA分子
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因
目的基因
两种工具酶分别是？
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
1’
目的基因
1
载体
2
2’
目的基因与质粒连接
正向连接 反向连接
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
3.基因表达载体构建过程
(1)如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
3.基因表达载体构建过程
(1)如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
？
②质粒与目的基因会发生反向连接
①质粒、目的基因会发生自身环化连接
单酶切的缺点：
(2)如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
双酶切
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
3.基因表达载体构建过程
(2)如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
双酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
基因工程的基本操作程序 | 第2步 基因表达载体的构建
(4)根据质粒的特点确定限制酶的种类
练习
构建基因表达载体：为使目的基因与载体正确连接，应用______________________两种不同限制酶的来分别切割载体和目的基因。
Pvit Ⅱ和EcorR Ⅰ
练习
(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 （　 　）
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子 （　 　）
(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
练习
图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 (　 　)
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
D
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
P80-81
将目的基因导入受体细胞的方法
受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
(常用)
转化
指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程
实质: 基因重组
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
P81
1.将目的基因导入植物细胞
冠瘿瘤
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等
(1)农杆菌转化法
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
P81
1.将目的基因导入植物细胞
为什么农杆菌容易感染双子叶植物？
科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有
(1)农杆菌转化法
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
P81
1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌特点：
·能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物。
·农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
①载体：
②受体细胞：
农杆菌Ti质粒
主要是双子叶植物和裸子植物
随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功
(1)农杆菌转化法
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
P81
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
构建表 达载体
含目的基因的重组Ti质粒
表现出新性状的植株
导入植物
细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
目的基因
Ti质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
③过程
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
农杆菌
基因表达载体
构建
转入
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
P81
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
·用农杆菌感染时，优先选择 （受伤的/完好的）叶片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由是？
______________________________________________________________________
受伤的
叶片伤口处的细胞会释放酚类物质，可吸引农杆菌
·若要利用农杆菌转化法转化单子叶植物细胞，可采取添加 ，其目的是 。
·利用Ti质粒构建重组质粒的目的是：
酚类物质
吸引农杆菌移向受体细胞，有利于目的基因成功转化
将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用其将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性稳定维持和表达
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
P81
1.将目的基因导入植物细胞
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株
b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等
(1)农杆菌转化法
④根据受体植物的不同，所用的具体转化方法不同：
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
B.在植物受粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊
(2)花粉管通道法
(我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法)
A.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
如：
P80-81
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
2.将目的基因导入动物细胞
(1)方法：
P82
(2)受体细胞：
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
(3)过程
显微注射法
受精卵
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
(1)常用方法：
P82
(2)受体细胞：
Ca2+处理法
常选择原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）
目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养
(3)过程：
大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态
溶于缓冲液中的重组DNA分子
转化
CaCl2(Ca2+)
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
(4)应用实例
P82
利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
转录
翻译
加工
如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？
一般不能产生原来的蛋白质
原因：
①原核生物细胞里没有相应的机制来去除内含子；
②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）
相应机制剪切内含子
转录出来的序列
真核基因：编码区（外显子+内含子）
前体mRNA
成熟mRNA
多肽链
蛋白质
基因工程的基本操作程序 | 第3步 将目的基因导入受体细胞
种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞 -
转化过程 目的基因插入Ti质粒的 T-DNA上→ 农杆菌（Ca2+处理）→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
【小结】
农杆菌转化法
花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受精卵
常用原核细胞
1.实验原理
(1)利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理；
DNA半保留复制
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课本P84-85
1.实验原理
(2)DNA片段电泳鉴定的原理
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课本P84-85
①DNA分子具有_______________，在一定的_____下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_______的作用下，这些__________会向着____________________的电极移动，这个过程就是_______
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_________________来鉴定
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________、________________和______等有关
④凝胶中的DNA分子通过______，可以在波长为________的_______下被检测出来
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
DNA分子在一定pH的缓冲液中可以带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动
2.材料用具
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课本P84-85
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
2.材料用具
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课本P84-85
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
3.方法步骤
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课本P84-85
(1)DNA片段的扩增
①移液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
预变性：
3.方法步骤
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课本P84-85
(2)DNA片段的电泳鉴定
④配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
⑤制备凝胶
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内
梳子孔为加样孔，
加样孔侧连电极负极
3.方法步骤
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课本P84-85
(2)DNA片段的电泳鉴定
⑧加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(Marker)
⑨电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
⑩观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课本P84-85
注意:
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套
3.方法步骤
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课本P84-85
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该图示片段大小约为750bp
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
A. PCR产物的分子大小在250至500bp之间
B. 3号样品为不含目的基因的载体DNA
C. 9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D. 10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
练习
3号PCR结果包含250~500bp片段，应包含目的基因
用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到如图所示电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是（　　）
B
9号PCR结果不包含250~50bp片段，所以不是所需转基因植株

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