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科普课：重叠PCR技术
致敬：凯利·穆利斯
凯利·穆利斯（Kary Banks Mullis，1944年12月-2019年8月7日），美国著名化学家，因发明高效复制 DNA片段的“聚合酶链式反应（PCR）”方法而获得1993年诺贝尔化学奖。
一.PCR技术
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、扩增增强因子，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
DNA聚合酶：
①具有5’→3’聚合酶活性，这就决定了DNA只能沿着5’→3’方向合成；
②需要引物，DNA聚合酶不能催化DNA新链从头合成，只能催化dNTP加入核苷酸链的3'-OH末端。因而复制之初需要一段DNA引物的3’一OH端为起点，合成5’→3’方向的新链。
DNA
5’
5’
3’
3’
5’
引物A
5’
引物B
二.重叠PCR技术
1.重叠PCR技术的定义
重叠延伸PCR技术 (gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。
这项技术目前主要有两个应用方向：构建融合基因；基因定点突变。
引物A
引物B
设计：不同基因的引物互补序列
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
将基因M和基因N链接起来的方法，我们可以用同尾酶切割，再用DNA链接酶将他们连在一起。但有时我们并不一定能够找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶的特殊性（价格，保存），因此使用限制酶和DNA连接酶很难得到产物。
基因M
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
基因N
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
重叠PCR技术可以将基因M和基因N链接起来。其过程为：
基因M
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
基因N
设计引物
PCR扩增两端
回收两端片段
两端片段退火延伸
扩增全长基因
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
基因M
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
基因N
引物B
引物A
引物C
引物D
①设计引物
D’与引物D互补配对
A’与引物A互补配对
D’
A’
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
基因M
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
基因N
引物B
引物A
引物C
引物D
②PCR扩增两端
D’与引物D互补配对
A’与引物A互补配对
D’
A’
PCR只扩增两个引物之间的DNA片段，因此我们只分析其构建的两个引物（D’-A引物，A’-D引物）的与之结合的DNA链的复制。因为设计的这两个因为碱基互补配对，所以基因M,基因N要单独进行PCR扩增。
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
基因M
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
基因N
引物B
引物A
引物C
引物D
②PCR扩增两端
D’与引物D互补配对
A’与引物A互补配对
D’
A’
5’
3’
A
D’
5’
3’
D
A’
PCR扩增第一次
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
②PCR扩增两端
D’与引物D互补配对
A’与引物A互补配对
5’
3’
A
D’
5’
3’
D
A’
PCR扩增第二次
5’
3’
A
D’
5’
3’
D
A’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
引物B
A’
D
5’
3’
引物C
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
③回收两端片段 并进行④两端片段退火延伸
5’
3’
A
D’
5’
3’
D
A’
5’
3’
引物B
A’
D
5’
3’
引物C
为了方便理解，我们把这4条链编上序号：1、2、3、4，退火后的结果为：
A
D’
1
5’
3’
1
2
3
4
5’
3’
4
D
A’
A
D’
引物C
A
D’
3
5’
3’
5’
引物B
A’
2
D
3’
基因M和基因N重叠区域
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
⑤扩增全长基因
D
A’
A
D’
1
5’
3’
5’
3’
4
引物C
A
D’
3
5’
3’
5’
引物B
A’
2
D
3’
DNA聚合酶：具有5’→3’聚合酶活性，这就决定了DNA只能沿着5’→3’方向合成；
（ ）
（ ）
√
×
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
⑤扩增全长基因
3
引物C
A
D’
5’
3’
5’
引物B
A’
2
D
3’
DNA聚合酶：具有5’→3’聚合酶活性，这就决定了DNA只能沿着5’→3’方向合成；
（ ）
√
DNA聚合酶会结合在该DAN分子上，继续完成该DNA的合成，进而将基因M,基因N链接在一起
DNA聚合酶
DNA聚合酶
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（2）定点突变
设计四种引物，用第一对引物（a、b）扩增含有突变位点及其上游序列的 DNA 片段，第二对引物（c、d）被用来扩增含突变位点及其下游序列的 DNA 片段，两个侧翼引物（a、d）含野生型序列，两个突变引物（b、c）含有希望引进的突变位点，如置换、插入或缺失的碱基（红点）。混合两次 PCR 的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火、延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次 PCR，即可得到目标突变体。
突变引物b和突变引物c碱基互补配对并含有用于替换、插入或缺失的碱基
5’
5’
3’
3’
上游引物a
下游引物d
突变引物c
突变引物b
(独立体系1)PCR
c
a
d
b
(独立体系2)PCR
5’
3’
5’
3’
重叠、延伸
a
5’
3’
d
5’
3’
3’
5’
3’
5’
PCR
二.重叠PCR技术
例1.（北京 海淀 期中）萝卜的蛋白A具有广泛的抗植物病菌作用，而且对人体没有影响。我国科学家欲获得高效表达蛋白A的转基因大肠杆菌作为微生物农药，做了相关研究。
（1）研究者用相同的 酶处理蛋白A基因和pET质粒，得到了重组质粒，再将重组质粒置于经 处理的大肠杆菌细胞悬浮液中，获得转基因大肠杆菌。
（2）检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好。因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按图2方式依次进行4次PCR扩增，以获得新的蛋白A基因。
限制酶和DNA链接酶
氯化钙
引物A 引物B 引物C 引物D
PCR1
PCR2
PCR3
PCR4
二.重叠PCR技术
①这是一种定点 技术。
②图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若选用该引物划“×”）
基因突变
√
√
×
×
×
×
√
√
×
×
×
×
√
×
×
√
二.重叠PCR技术
（3）研究者进一步将含有新蛋白A基因的重组质粒和
分别导入大肠杆菌，提取培养液中的蛋白质，用 方法检测并比较三组受体菌蛋白A的表达产物，判断蛋白A基因表达效率是否提高。为检测表达产物的生物活性。研究者将上述各组表达产物加入到长满了植物病菌的培养基上，培养一段时间后，比较 大小，以确定表达产物的生物活性大小。
（4）作为微生物农药，使用时常喷洒蛋白A基因的发酵产物而不是转蛋白A基因的大肠杆菌，其优点是 。
含有蛋白A基因的重组质粒
空质粒（pET质粒）、
抗原-抗体杂交
抑菌圈
①对人、畜、农作物和自然环境安全；②不会造成基因污染；
③有效成分纯度高
二.重叠PCR技术
通过这道题，我们对PCR定点突变的应用有了更深一层的认识。如果还是有疑问可以查阅相关资料或者添加我的微信，我们一起探讨一下。PCR技术还有很多应用：如检测基因型、分子克隆、基因敲除等，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。
【生活可以简陋，但不可以粗糙】

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