资源简介

(共31张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
（第1课时）
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)
基因工程的基本操作程序
培育转基因抗虫棉的简要过程
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
导入
抗虫基因
（Bt抗虫蛋白基因）
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取（前提）
2.基因表达载体的构建（核心）
3.将目的基因导入受体细胞（关键）
4.目的基因的检测与鉴定（保证）
(含抗虫基因）
（含有并表达抗虫基因）
抗虫基因已插入染色体DNA中
一、目的基因的筛选和获取
概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。
1.目的基因
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
（也可以是一些具有调控作用的因子）
一、目的基因的筛选和获取
2.目的基因的筛选
筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。
实例：
Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程
苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
Bt抗虫蛋白的抗虫原理：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
一、目的基因的筛选和获取
3.目的基因的获取
（1）从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
类型：
基因组文库:
部分基因文库
包含一种生物的全部基因
（如cDNA文库）：
包含一种生物的部分基因
（2）人工合成法：
（化学合成法、逆转录法）
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。
DNA合成仪
（3）利用PCR技术获取和扩增
一、目的基因的筛选和获取
（3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR扩增仪
一、目的基因的筛选和获取
回顾：DNA复制的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
模板
原料
能量
酶
解旋酶：打开DNA双链
DNA聚合酶：催化合成DNA子链
四种游离的脱氧核苷酸
ATP
打开的两条DNA母链
PCR条件
DNA模板（需含有目的基因）
四种脱氧核苷酸
(或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP)
一、目的基因的筛选和获取
补充：dNTP
脱氧腺苷三磷酸（dATP）
腺嘌呤脱氧核苷酸
脱氧腺苷二磷酸（dADP）
脱氧腺苷（dA)
腺嘌呤
脱氧
核糖
P
P
P
~
~
OH
H
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。
——脱氧核苷三磷酸
一、目的基因的筛选和获取
回顾：DNA复制的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
模板
原料
能量
酶
解旋酶：打开DNA双链
DNA聚合酶：催化合成DNA子链
四种游离的脱氧核苷酸
ATP
打开的两条DNA母链
PCR条件
①DNA模板（需含有目的基因）
②四种脱氧核苷酸
(或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP)
③耐高温的DNA聚合酶
（不需要解旋酶，DNA在高温下解旋）
⑤能严格控制温度的温控设备
PCR扩增仪
④稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+激活DNA聚合酶）
⑥引物
（分别与模板DNA相结合的2种引物）
DNA复制的过程
一、目的基因的筛选和获取
拓展：引物
A T C G A A T C G G T T
T A C C T T A G C C A A
DNA
聚合酶
母链
DNA
子链
DNA
引物
3′
3′
5′
5′
DNA聚合酶
①因为DNA复制时，子链延伸的方向都是从5’→3’端
②DNA聚合酶不能从头合成子链，只能从3’端延伸DNA链
一、目的基因的筛选和获取
拓展：引物
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
子链延伸方向5’ 3’
PCR扩增的前提是：
根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物（不需要知道整个目的基因的碱基序列）
由于DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增，PCR扩增时至少需要2种引物
引物的作用：定位目的基因的位置，与模板连结合，并为子链的延伸提供起点。
一、目的基因的筛选和获取
【现学现用】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
△设计两种引物的要求：
②引物自身不能环化
①两种引物之间不能互补配对
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合
一、目的基因的筛选和获取
【现学现用】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。
DNA聚合酶只能特异地复制处于　　　　 之间的DNA序列，
（3）若用PCR技术扩增图示目的基因，
应选用的引物是 。
两个引物
从子链的5′端向3′端延伸
引物甲、引物丙
一、目的基因的筛选和获取
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
引物
待扩增DNA片段
5’
5’
变性
温度上升到90℃以上，双链DNA解旋为单链
复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
PCR反应的过程
一、目的基因的筛选和获取
3’
3’
3’
3’
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
PCR得到的DNA产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定
比较PCR反应与体内DNA复制所需的基本条件
在DNA复制中的作用 体内DNA复制条件 PCR反应条件
DNA母链
DNA母链
解旋酶
高温条件（90℃以上）
4种脱氧核苷酸
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶
一小段RNA
（人工合成的）一小段DNA
提供DNA复制的模板
断裂氢键，
打开DNA双链
合成子链DNA的原料
催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链
使DNA聚合酶结合在引物的3’端，从而开始连接脱氧核苷酸（引物）
基因的选择性表达
复性
琼脂糖凝胶电泳
限制酶和DNA连接酶
在培养基中添加四环素
湿热灭菌
蛋白质
典例：2023广东省一模
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
真核细胞的基因结构
DNA
基因1 基因2 基因3
放大
转录
内含子
内含子
外显子
原核细胞里没有该类酶
真核基因的编码区是不连续的，存在外显子与内含子之分。
mRNA单链
提取
逆转录酶
DNA单链
DNA双链
酶
这种双链DNA是不含内含子的DNA，叫做cDNA
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
原核基因的编码区是连续的，不存在外显子与内含子之分。
二、基因表达载体的构建
获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因（目的基因）能够表达和发挥作用。
构建基因表达载体
（核心步骤）
基因表达载体由哪些部分组成
二、基因表达载体的构建
基因表达载体
启动子：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
终止子：
终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。
标记基因：
目的基因：
复制原点：
便于重组DNA分子的筛选。
能控制表达所需要的特殊性状。
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
DNA复制的起始位点。
启动子 终止子 起始密码子
终止密码子
位置
作用
DNA
mRNA
转录的起点和终点
翻译的起点和终点
载体≠表达载体
二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
二、基因表达载体的构建
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端切口
带有相同黏性末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
基因表达载体构建过程（课本P80）
对点练9.(2022·北京朝阳高二期末)RT－PCR是以提取的RNA为模板，经反转录获得与之互补的DNA(cDNA)序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增。具体过程如图所示。以下有关RT－PCR的叙述正确的是
A.过程1需要使用耐高温的DNA聚合酶
B.过程2中的引物B可与mRNA互补配对
C.游离的脱氧核苷酸只能加到引物的5′端
D.RT－PCR可用于对RNA病毒的检测与鉴定
√
10.(2022·天津市高二阶段练习)研究人员用下图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点)，将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。以下叙述不正确的是
A.构建重组质粒的过程应选用BclⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶
B.使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组
C.能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠杆菌
D.利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙
√
变式训练.(2022·湖北黄石高二期中)基因工程是一种
DNA 操作技术，其表达载体的构建和检测筛
选是两个重要步骤。右图1为某种质粒简图，
箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的
酶切位点。已知目的基因X的两端分别有包
括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位
点。图2表示运用影印培养法(指在一系列平
板培养基的相同位置上接种并培养出相同菌落的一种微生物培养方法)检测表达载体是否导入大肠杆菌。下列有关叙述错误的是
A.同时使用EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒，可
避免酶切后质粒的自身环化
B.转化方法是将质粒表达载体溶于缓冲液后
与经 Ca2＋处理的大肠杆菌混合
C.培养基 A 和培养基 B分别含有四环素和青霉素
D.从筛选结果分析，含目的基因X的菌落是
4和6
√
13.在基因工程中利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是
A.构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ
切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B.构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ
切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C.图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
D.用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，
只能产生一种重组DNA
√

展开更多......

收起↑