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考情
1.考查题型：基因工程多以简答题呈现
2.命题趋势：基因工程几乎每年均有考查，多以基因工程的基本程序为背景，既可单独考查其中相关的生物学原理和注意事项，也可结合细胞工程、发酵工程进行综合考查。
①PCR为目的基因提供酶切位点等内容相对困难，需要做全方位梳理
②基因工程难度大，需要多练限制酶选择，正反接检测和基因编辑等情景
模块五 生物技术与工程 03 基因工程
概念5 基因工程赋予生物新的遗传特性
5.1基因工程是一种重组DNA 技术
5.2蛋白质工程是基因工程的延伸
一、基因工程的3种基本工具
（1）根据目的基因确定限制酶
①应选择位于目的基因两端的限制酶；
②不能选择目的基因内部的限制酶；（2）根据质粒的特点确定限制酶
①通常选择与切割目的基因相同的限制酶，确保出现相同的黏性末端；
②在只有一种标记基因时，选择的限制酶不能破坏标记基因。
二、熟记基因工程的四个操作步骤
例1.基因工程载体是DNA重组技术使用的基本工具。回答下列问题：
1)大肠杆菌的质粒常被用来做基因工程中的载体，其主要优点是_______
______________________________________________(至少两项)。基因工程中常使用的载体除质粒外，还有_________________________(至少两项)。
2)在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造过的。在构建基因表达载体时，通过人工改造，基因表达载体中除了含有目的基因外，还必须有________________________等。构建目的基因表达载体的目的一方面是使目的基因在受体细胞中________，并遗传给下一代；另一方面，使目的基因能够________________，从而得到转基因产品或生物。
能自主复制，有标记基因，有一个至多个酶切位点
噬菌体、动植物病毒
启动子、终止子和标记基因
稳定存在
表达并发挥作用
例2.（2022湖北节选） 提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系。
3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用_________________酶切割S基因的cDNA和载体。
XbaⅠ、HindⅡ
例3.（2021 辽宁）（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入________和________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用________________（填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
EcoRI
PvitⅡ
T4DNA连接酶
例4.科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。该过程所用的质粒A与含生长激素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示，其中切割位点相同的酶不重复标注。限制性内切核酸酶????????????????Ⅰ、????????????Ⅰ、????????????????????Ⅰ、???????????????? Ⅲ，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为????↓????????????????????、
????↓????????????????????、↓????????????????、????↓????????????????????，下列相关叙述错误的是( )。
?
A.图1质粒中未标注出的结构是复制原点
B.图2中的DNA用???????????????????? Ⅰ完全酶切后，反应管中有4种DNA片段
C.????????????????Ⅰ酶切的DNA末端与 ????????????????????Ⅰ酶切的DNA末端连接，连接部位用????????????????Ⅰ一定能切开
D.在构建基因表达载体时，为防止目的基因的反向连接，应选用限制酶 ???????????????? Ⅲ和????????????????Ⅰ切割质粒，选用限制酶 ???????????????? Ⅲ和 ???????????? Ⅰ切割含目的基因的DNA片段
?
C
例5.用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶的酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是( )。
C
A.图1中限制酶 ????、????识别的核苷酸序列不相同
B.图1中????代表的碱基对数为4500
C.推测图1中????是限制酶????的酶切位点
D.推测图2中①是限制酶????处理得到的酶切产物
?
例6.为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因????????????和尾穗苋凝集素基因????????????与载体 ????????????????????????结合，然后导入棉花细胞。下列操作与实验目的不符的是( )。
?
A.用限制酶????????????????Ⅰ和DNA连接酶处理两种基因可获得?????????????????????????融合基因
B.与只用????????????Ⅰ相比，用????????????Ⅰ和????????????Ⅰ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
C.将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞
D.用PCR技术可检测????????????和????????????基因是否导入棉花细胞中
?
C
例7.人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。下图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的部分过程。图中???????????????? 表示四环素抗性基因，???????????????? 表示氨苄青霉素抗性基因，4种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题：
?
（1）为构建重组载体，应选择 酶和 酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为 。
（2）以大肠杆菌为受体细胞，将酶切后的连接产物导入受体细胞。为筛选出导入目的基因的受体菌，首先需要将得到的上述大肠杆菌接种到 的培养基（A）上，一段时间后，将????上生长的菌落拓印到含 的培养基（B）上，在????上能生长的 （填“是”或“不是”）成功导入重组质粒的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是 。
?
含氨苄青霉素
四环素
BamHⅠ
BclⅠ
BamHⅠ和BclⅠ酶切形成的粘性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
不是
双抗生素标记法
限制酶




识别序列（箭头表示酶切的位置）



?????????????????????????????????????????????????? 、?????????????????????????????????????????????????
?
例8.为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取如下措施：①基因策略：包括提高杀虫基因的表达量、向棉花中转入多种杀虫基因等。例如，早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现在经常将两种或两种以上Bt基同时转入棉花。②田间策略：主要是为棉铃虫提供底护所。例如我国新疆棉区，在转基因棉田周围种植一定面积的非转基因棉花，为棉铃虫提供专门的庇护所：长江、黄河流域棉区多采用将转基因抗虫棉与高粱和玉米等其他棉铃虫寄主作物混作的方式，为棉铃虫提供天然的庇护所。③国家宏观调控政策：如实施分区种植管理等。关于上述基因策略，下列叙述错误的是（ ）
A.提高Bt基因的表达量，可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度
B.转入棉花植株的两种Bt基因的遗传不一定遵循基因的自由组合定律
C.若两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，则两种基因互为等位基因
D.转入多种Bt基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向
C
1.原理与条件
体内复制引物是RNA
引物的基本要求：
?引物自身不能环化
?两种引物之间不能互补配对
?引物长度不宜过短，防止引物随机结合
三、PCR的原理和多项复杂情景
结论：
① n次复制后含有引物A的_______个。
含有引物B的_______个。同时含有引物A和B的_______个。
②从第____次扩增开始能够获得单纯的目的基因。
3
2n-1
2n-1
2n-2
2. PCR过程
三、PCR的原理和多项复杂情景
例9. 运用PCR技术从DNA中扩增目的基因的过程中，引物的 ????′ 端为结合模板DNA的关键碱基， ????′ 端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是( )。
?
A.该图表示PCR循环中的变性环节
B.????????????????作为扩增的原料会依次连接到????′端
C.耐高温的DNA聚合酶催化配对的????????????????间形成磷酸二酯键
D.用图中引物扩增两个循环后可获得目的基因
?
B
例10.小鼠肿瘤转移抑制基因（ kiss1 基因）仅在特定组织中表达。在雌激素诱导下，细胞内信号传导系统可以与 kiss1 基因启动子的特定区域结合，激活 kiss1 基因的转录
?
研究者扩增了 kiss1 基因启动子不同长度的片段P1、P2、P3和P4，分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因（G）融合的载体，转入体外培养的特定细胞中，在培养液中添加雌激素，以确定不同片段的转录活性。下列叙述不正确的是
?
A.为了使PCR获得不同长度的DNA片段，需要使用5种引物
B.应选择有 kiss1 基因但不能表达的小鼠细胞作为转化的受体细胞
C.在细胞中表达出绿色荧光强度高的片段具有较高的转录活性
D.该启动子能响应外源激素信号，可在基因工程中发挥重要作用
?
B
例11.通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变，下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基 T 不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶 a 和限制酶 b 的识别位点。下列有关叙述正确的是( )。
?
A.限制酶 a 和限制酶 b 的识别位点分别加在引物1和引物2的 3′ 端
B.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、 Ca2+ 等
C.第2轮PCR中，引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占 1/4
?
D
例12.某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。
1.若拟突变位点的碱基对为A—T，
则需要让其突变为_______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为__________(假设引物为单链DNA)。
C—G或T—A
G或A
2.中引物2或引物3设计的要求是
将两个基因的未端序列设计在同一引物中（或引物2和引物3中必须具有互补配对的片段）
例13．荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图）。下列说法不正确的是（ ）
A．若循环次数相同，荧光值越高，证明新冠病毒感染程度越高
B．该技术需要用到一对引物，且引物之间的碱基序列不能互补
C．该技术中DNA聚合酶只能从引物的3' 端开始延伸DNA链
D．若要检测某目的基因在受体细胞的转录水平，可直接提取mRNA进行扩增
D
1. CRISRP/Cas9
CRISPR 相关基因位于细菌中。当外源 DNA 入侵细菌时，细菌将其作为新的“间隔序列”整合到自己的基因组中，从而使 CRISPR 相关基因能“记住"攻击过自己的外源基因。当再次遇到该外源基因时能对其进行识别、定位和剪切，以达到保护自身的目的。其中 crRNA为 CRISPR 相关基因的转录产物，其与 Cas 酶结合就能起到基因剪辑的作用。
拓展
1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________________。
DNA连接酶
例14.[2021海南] CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。
3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是碱基互补配对。随后，Cas9蛋白可切割____________________序列。
Ca2+处理法
目标DNA特定的核苷酸序列
5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。
CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
例15.地球上纤维素含量丰富，其酶解产物利用非常广泛，但通常存在纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等问题，导致生产成本较高，影响其在生产生活中的应用。采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造，可有效解决纤维素酶活性低下、催化能力较弱的问题。回答下列问题：
1)蛋白质工程是通过_____________________，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。与基因工程相比，蛋白质工程可以生产__________________。
3)纤维素酶的结合域（CBM）在纤维素的降解中扮演着重要角色，研究发现通过对CBM活性部位的2个色氨酸残基进行改造，会得到能持续催化水解纤维素的纤维素酶，请概述获得该种纤维素酶的大致流程：_________________________________________________________________
基因修饰或基因合成
新的蛋白质
预期新的纤维素酶的功能，设计蛋白质结构，推测在原有序列改造两个色氨酸残基后应有的氨基酸序列，找到到对应的DNA序列人工合成并扩增以得到大量基因片段，导入酵母细胞并使之稳定表达，得到表达产物纤维素酶
4) 纤维素酶连接区的主要作用是柔性连接催化域和结合域，多数由脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸等组成，极易被蛋白水解酶水解，但经糖基化修饰后可以很好地防止蛋白水解酶的水解。推测原因可能是_______________________________________________________________________________。为了深入研究其功能，尽可能地提高纤维素酶的活性，对连接区的改造研究主要体现在__________________________________（答两点）等方面。
5) 对纤维素酶的改造，还可以通过蛋白质定向进化手段实现，为了达到最终的结果，在研究中只需要人为地为蛋白质制造进化条件，就能够使纤维素酶的基因发生改变。与传统的蛋白质工程相比较，该方法具有的优点是__________________________________________（答一点）。
氨基酸序列和蛋白质的空间结构
减少筛选量，减少人工操作步骤
糖基化修饰后酶连接区空间结构发生改变，使色氨酸残基暴露而易被水解的氨基酸被隐藏
(3)融合基因的种类
①由报告基因和功能基因构成的融合基因。常用的报告基因有：GFP（绿色荧光蛋白）基因、GUS基因、LacZ基因和Luciferasese（虫荧光素酶）基因等，主要目的是对功能基因进行示踪，研究其功能及特性。　
②由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合基因。其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白，为生产或科研所用。
③功能基因与功能基因的融合可分为两类：A.相同功能基因的融合，目的是增强基因的功能，扩大基因的应用范围，如杀虫基因之间的融合。B.不同功能基因的融合，为特殊需要而构建，如生产无毒疫苗等。
④报告基因与抗药性基因的融合用于构建融合载体，以利于插入大片段的cDNA或作为双功能标记.
2.融合基因的原理和应用
(1)概念：融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，构成嵌合基因。
(2)表达产物：融合基因的表达产物为融合蛋白
拓展
例16.[2023深圳一模] 表面展示技术是通过重组DNA技术，将外源蛋白与细胞表面的蛋白质组装成融合蛋白，从而可展示在细胞表面。回答下列问题。
1) 若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，下图中最适合通过绿色荧光（绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光）确定融合蛋白成功表达的是_____。
注:Ampr为氟卡青霉素抗性基因;→表示转录方向;UAG，UAA，UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。
例17.[2018·全国Ⅱ] 某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-?GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：
1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是___________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证_______________________。
甲的完整
甲与载体正确连接
E1和E4
例18.B基因存在于水稻基因组中，其在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。
注：Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光
5)个体水平如何筛选出能表达B基因的转基因植株____________________
(1)图中所示的基因表达载体需含有启动子，它是_____识别并结合的位点。
(2)可利用_____细胞中的RNA和PCR技术获取大量的B基因，该过程需要用到_____酶；获得B基因中编码蛋白的序列后，将该序列与Luc基因连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建基因表达载体。
(3)用_____处理农杆菌，使细胞处于一种_____的生理状态，然后将重组的基因表达载体导入其中。
(4)外植体经_____形成的水稻愈伤组织放入农杆菌液浸泡后进行植物组织培养，培养基中需加入_____进行筛选。
加入荧光素后检测该植株卵细胞中是否发出荧光
3.酵母双杂系统的原理
酵母细胞基因转录需要转录因子，转录因子包括DNA结合功能域（DNA-BD）和转录激活结构域（DNA-AD），两结构域分开时不能激活转录。
将待测蛋白质X与DNA-BD融合，蛋白质Y与DNA-AD融合，蛋白质X和Y有相互作用时，两结构域能重新呈现完整转录因子活性，并可激活报告基因的转录。
常见报告基因：①包括荧光素酶基因
②绿色荧光蛋白(GFP) 基因。
③β-半乳糖苷酶基因（LacZ），LacZ表达的酶可以将无色化合物X-gal水解成蓝色产物。
拓展

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