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(共32张PPT)
第二节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
如何从混杂的微生物中分离得到纯种的目标微生物？
分离得到的纯种微生物的数量又如何去测定？
平板划线法、稀释涂布平板法
由不同微生物个体繁殖后代组成的大片菌落
单菌落：由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团

稀释涂布平板法和显微镜计数法（需用到血细胞计数板）
一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
（一）平板划线法
连续平行划线和扇形划线
1.操作要点
注意：
（1）无论是何种划线法，蘸取菌种前和划线后，接种环都要灼烧灭菌。
（2）无论是何种划线法，菌种只蘸取一次。
平板划线操作中三种灼烧的目的不同
1.蘸取菌液前灼烧
2.每次划线前灼烧
3.划线操作结束后灼烧
避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。
杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端。
及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。
思考：
连续平行划线法，单菌落一般出现在划线的什么位置？
（二）稀释涂布法
1.操作要点
梯度稀释和涂布平板
（1）样品梯度稀释
在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
9mL无菌水
1ⅹ10
90mL无菌水
10g
（2）取样涂布平板
①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
②取0.1mL菌液，滴加到培养基表面
③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
（二）稀释涂布法
1.操作要点
注意：
1.每次稀释都要换一支吸管
2.分离得到单菌落一般以培养皿中有20个以内菌落为宜。
3.计算微生物数量一般以培养皿中有30～300个菌落为宜。
梯度稀释和涂布平板
平板划线法 稀释涂布法
工具
原理
特点
结果
相同点
平板划线法和稀释涂布法比较
接种环
涂布器（或玻璃刮刀）
在数次划线后培养，可以分离到有一个细菌细胞繁殖而来的，肉眼可见的细胞群体，即菌落。
在稀释足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落
方法简单，但不适宜计数
单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂。
使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
讨论
1.判断液体培养基中成功接种酵母菌的依据是什么？
否。①挑取单菌落接入糖水中,培养一段时间检查是否能产生酒味
②接入面团中观察能否发面;
③挑取菌落样品，制作临时装片，在显微镜下观察、识别
与未接种的培养基相比，接种的培养基由于酵母菌的增殖而变浑浊。
与用酵母菌纯种在固体培养基表面接种的结果相比，用样品稀释液接种的固体培养基表面出现特征相同的、最小菌落即认为可能是分离出了酵母菌单菌落。
若出现，可能是在接种过程中有杂菌污染
2.如何判断是否分离出酵母菌的单菌落？判断依据是什么？
4.仅从菌落特征是否能够认定你分离出了酵母菌？怎样进行进一步的鉴定？
3.在固体培养基表面涂布的菌种是否出现形态、颜色不同的单菌落？你认为出现该现象的原因是什么？
活动：接种、培养并分离酵母菌
问：以上两张图分别是平板划线法和稀释涂布平板法培养细菌的结果。如果要对菌落进行计数，则哪种方法可行？为什么？得到的细菌数量是确切的细菌数量吗？
1.间接计数法——稀释涂布平板法
（1）原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
二、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
①一般选择菌落数为30～300的平板计数。
②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
③适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
（2）计数原则
（3）结果分析
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；
②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（4）计算公式
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M代表稀释倍数。
无法计数 159 17 2 0
无法计数 141 13 1 0
无法计数 150 11 3 1
例：将1g土样加到盛有99ml无菌水的三角瓶中，如图进行稀释，每个稀释度涂布三个平板，根据结果计算1g土样中菌的数量？
（159+141+150）÷3×10×105
=1.5×108个/g
（1）血细胞计数板
2.直接计数法——显微镜计数法
计数池
计数室
1mm
0.1mm
每块计数板由H形凹槽分为两个同样的计数池。
每个计数池分为9个大方格，其中间的一大方格又称为计数室，微生物的计数就在此大方格中进行。
每个计数室面积1mm2，液体高度0.1mm，所含液体体积为0.1mm3。
计数室
16个中方格
25个中方格
16×25
25×16
每个计数室（大方格）共400个小方格，其面积是1mm2，总体积为0.1mm3。
一个计数室有
小方格400
25个小方格
16个小方格
（2）抽样检测法
16个中方格
25个中方格
16个小方格
25个小方格
（3）如何统计结果
对压线细胞计数时，数上不数下，数左不数右。
方格内+左边及左上线压线细胞数。
取多个中方格求平均值
（4）计算
酵母菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
×稀释倍数
10-4
0.1mm3=0.1×10-3cm3=10-4mL
2.从试管中析出培养液进行计数之前，为什么要将试管轻轻震荡几次？
使酵母菌分布均匀，以保证估算的准确性，减少误差。
3.需要重复实验吗？
不需要，计数时取多个方格求平均值。
1.一般情况下，计数所得酵母菌种群数量，比实际值大还是小？为什么？
会比实际要大。因为在计数所得的数据包含了死菌和活菌。
思考？
三、调整培养基配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
3.培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长。
1.不同自然环境中生活着的微生物代谢类型不尽相同。
2.许多微生物的代谢方式并不唯一。
在培养基中添加（或减去）某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其它微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。
培养基中加青霉素
LB培养基应有菌落
没有青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗青霉素能力的细菌
没有青霉素抗性的细菌
具有青霉素抗性的菌落
能分解尿素的微生物的分离与计数
1.原理
尿素在脲酶催化作用下分解：
（NH2）2C=O + H2O
2NH3 + CO2
脲酶
（1）制备培养基
LB培养基
尿素固体培养基
酵母提取物 0.48g
蛋白胨 1g
NaCl 1g
琼脂 2g
蒸馏水 定容到100ml
葡萄糖 0.1g
K2HPO4 0.48g
NaCl 0.48g
酚红 2.1g
尿素CO(NH2)2 8g
琼脂糖 2g
蒸馏水 定容到60+40ml
讨论
1.从物理性质看两种培养基属于哪类？依据是什么？
2.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？
3.两种培养基中共有哪些成分？哪些作为碳源、氮源？
4.尿素固体培养基是如何灭菌的？
2.步骤
（2）培养与观察
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
LB培养基
尿素培养基
为什么同一稀释度下，LB培养基上的菌落数比尿素培养基上多？
（3）结果
1.在接种过程中，若用同一移液器吸取菌液，且不按照稀释度由大到小的顺序依次操作，是否会影响实验结果，为什么？
2.根据图1-20所示的培养结果，在估算土壤中能分泌脲酶的微生物的数量时，应统计哪个稀释度的培养皿？为什么？
讨论题
不按照稀释度由大到小的顺序依次操作会影响实验结果。如果先取用稀释度小的溶液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致较大的统计误差。
应统计稀释度为10-3的3个培养皿中的菌落数后取平均值。因为这个浓度的培养皿中菌落数比较适中，计数的结果误差较小。
这些微生物能够合成脲酶而将尿素分解成氨。氨可使培养基的碱性增强，培养基pH升高，含酚红指示剂的培养基变成红色。而且，红色环带与菌落面积之比越大，说明该菌落分解尿素的作用越强。
3.在图1-20中，培养皿E中许多菌落周围颜色发生明显改变。这种现象说明了什么？
4.在图1-20中，培养皿F中还有许多菌落周围颜色未发生明显改变。针对此现象，有人认为“这些未变色的菌落有可能是能自生固氮的微生物，而不是能产脲酶的微生物”。你认为这个解释合理吗？请说明理由。
意见①：合理，因为自生固氮微生物能在固氮酶的作用下，将N2转化为可利用的氮源，故可在没有氮源的培养基上生长。可以挑取培养基未变色区域的菌落，清洗除去细胞表面的培养基后接种在无氮源的培养基上，观察其生长情况，从而证明其是否为能固氮的微生物。
意见②：不合理，因为F培养皿中微生物总数相对少于E培养皿，所以如果延长培养时间，培养基仍有可能改变颜色。
意见③：不合理，这些可能是能直接吸收尿素并作为氮源的微生物。

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