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发酵工程
第36课 微生物的培养技术及应用
1．培养基的配制
(1)概念：人们按照微生物对__________的不同需求，配制出供其__________的营养基质。
考点一　微生物的基本培养技术
营养物质
生长繁殖
(2)种类
①按物理状态可分为液体培养基和___________。
②按功能可分为选择培养基和___________。
(3)成分：各种培养基一般都含有水、_____、氮源和______，此外还要满足微生物生长对_____、特殊营养物质以及_____的需求。
固体培养基
鉴别培养基
碳源
无机盐
pH
氧气
(4)无菌技术的主要方法及适用对象(连线)
2．无菌技术
(1)目的：获得____________________。(2)关键：防止_____污染。
(3)措施：_____和_____。
纯净的微生物培养物
杂菌
灭菌
消毒
3．微生物的纯培养
(1)概念：由__________繁殖所获得的微生物群体是纯培养物，获得__________的过程就是纯培养。
(2)过程：包括___________、灭菌、接种、_____和培养等步骤。
(3)常用接种方法：__________法和____________法。
单一个体
纯培养物
配制培养基
分离
平板划线
稀释涂布平板
(4)实例——酵母菌的纯培养
　　　　
高压蒸汽灭菌
干热灭菌
平板划线法
倒置
未接种
微生物概述
微生物的概念：
_________________________的统称。
包括_______________________________等。
本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
难以用肉眼观察的微小生物
细菌、真菌、病毒及一些原生生物
禽流感病毒
SARS病毒
大型真菌
实验室培养微生物条件
1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
——培养基的配制
2）确保其它微生物无法混入
——无菌技术
高压蒸汽灭菌
固体培养基
3）将需要的微生物分离出来
——微生物的纯培养
微生物在其表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。
培养基的配制
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
01
1.概念：
2.作用：
3.类型：
固体培养基 液体培养基 半固体培养基
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
天然培养基
合成培养基
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
（1）基本成分：
水、碳源、氮源、无机盐。
碳源
无机碳源：
有机碳源：
氮源
NH4＋、NO3-、NH3等。
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。
CO2、CO32-、HCO3-。
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。
无机氮源：
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨：
均可提供碳元素、氮元素。
无机盐
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等
大量元素：
微量元素：
Ca、K 、Mg等
自养微生物
异养微生物
为什么培养基需要氮源？
是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
01
培养基的配制
01
牛肉膏
蛋白胨
（2）特殊需求：
满足微生物对 的需求。
④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。
例如：①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______；
②培养霉菌时，需要将培养基调至_____；
③培养细菌时，需要将培养基调至 ；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
pH、特殊营养物质、O2
01
培养基的配制
1．培养基只能用以培养、分离、鉴定、保存微生物，不能用以积累其代谢物。 ( )
2．琼脂固体培养基是实验室中最常用的培养基之一。 ( )
3．消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的微生物，包括芽孢和孢子。 ( )
4．配制培养基时应先灭菌再调pH。 ( )
5．平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧。 ( )
6．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。 ( )
×
√
×
×
√
×
1．(选择性必修3 P10旁栏思考)为什么培养基需要氮源？____________________________________________________________。
2．(选择性必修3 P10相关信息)牛肉膏和蛋白胨含有的营养物质有
_______________________________。
培养基中
的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的
糖、维生素和有机氮等营养物质
考向1| 培养基的成分与功能的分析
1．下列有关培养基的叙述，正确的是(　　)
A．培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质
B．培养基中都只含有碳源、氮源、水和无机盐
C．固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D．微生物在固体培养基表面生长，一定能形成肉眼可见的单个细菌繁殖而来的菌落
A
《新坐标》P369
2．(2021·山东卷)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是(　　)
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
B
乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染！
条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分微生物，不能消灭芽孢和孢子 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
紫外线消毒法 用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具(涂布器、接种环)、试管口或瓶口
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具
湿热灭菌法 培养基及容器　
无菌技术
02
芽孢
芽孢是某些细菌（如芽孢杆菌属）在营养条件缺乏时，在菌体内形成的一个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞，它是有丝分裂或减数分裂的产物。
孢子
考向2| 无菌技术的辨析
3．(2021·北京卷)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作错误的是(　　)
A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
C
取样后的棉拭子浸入无菌水制备菌液，取0.1 mL菌液滴加到培养基表面，再用灼烧灭菌过的且冷却的涂布器涂布，C错误
4．(2022·湖北卷改编)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　　)
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用高压蒸汽灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用高压蒸汽灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
D
【易错提醒】把握选择无菌技术的原则
(1)考虑无菌技术的效果：灭菌的效果比消毒要好。
(2)考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能消毒，而不能灭菌。
1．概念：由 繁殖所获得的微生物群体是纯培养物，获得 的过程就是纯培养。
03
微生物的纯培养
2．常用方法： 法和 法。
03
微生物的纯培养
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
微生物群
分散
单个细胞
单个菌落
繁殖
不同菌落的形状、大小、颜色等不同。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
3．方法步骤
1．制备培养基
配制培养基
灭菌
倒平板
培养基：高压蒸汽灭菌:100kPa、121℃，15-30min
培养皿：干热灭菌:160~170 ℃ ，灭菌2h
探究 · 实践 酵母菌的纯培养
步骤：
（酵母菌
计算→称量→溶化→定容
待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
将配好的培养基，转移到锥形瓶灭菌。
——马铃薯琼脂培养基）
防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；
防止培养基中的水分过快蒸发。
酵母菌的纯培养
平板划线法
注意：接种环灼烧的次数和时机。
探究·实践
2．接种和分离酵母菌
避免接种环上可能存在的杂菌污染培养物。
杀死接种环上残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端
第一步灼烧
每次划线前灼烧
划线操作结束时灼烧
杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离得到单个菌落（即由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体）。
平板划线法
酵母菌的纯培养
1
2
3
4
5
探究·实践
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
未接种的培养基表面是否有菌落生长，如果有，说明了什么？
在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了菌落？这些菌落的颜色、形状、大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析可能是哪些原因引起的吗？
3．培养酵母菌
步骤：
没有。 如果有，说明灭菌不彻底培养基被杂菌污染。
原因：接种的菌种不纯、无菌操作不规范。
考向3| 微生物的培养、纯化方法及过程分析
5．以下关于倒平板的操作，错误的是(　　)
A．在火焰旁取下装有培养基的瓶塞
B．倒平板前，让锥形瓶的瓶口迅速通过火焰
C．倒平板时将培养皿的盖拿开，以方便将锥形瓶中的培养基倒入培养皿
D．平板冷却凝固后要倒过来放置
C
6．(2021·山东卷)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭，硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是(　　)
A．乙菌的运动能力比甲菌强
B．为不影响菌的运动需选用液体培养基
C．该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D．穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
B
7．下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是(　　)
A．①步骤使用的培养基是已经调节过pH并灭菌的培养基
B．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
C．③到④的过程中，接种环共灼烧了5次
D．④步骤操作时，不能将第1次和第5次的划线相连
C
【易错提醒】培养物、纯培养物、纯培养的辨析
1．微生物的选择培养
(1)选择培养基：将允许特定种类的微生物生长，同时___________其他种类微生物生长的培养基。
(2)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养。
考点二　微生物的选择培养和计数
抑制或阻止
②涂布平板操作
培养基表面
酒精
涂布均匀
③培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板_____，放入30～37 ℃的___________中培养1～2 d。
2．微生物的数量测定
(1)利用稀释涂布平板法计数
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在_______的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对_个平板进行计数，并求______。
②统计结果往往比实际值__。
倒置
恒温培养箱
30～300
3
平均值
少
(2)利用显微镜直接计数
①需用细菌计数板或血细胞计数板。
②统计结果是________________的总和。
活菌数和死菌数
3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
　
脲酶
尿素
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
美国黄石国家公园
那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？
水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
启示：寻找目的菌时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中筛选出水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
思路：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
选择培养基
一
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
思路：
①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。
②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；
③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。
探究·实践 选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
(细菌生长的氮源)
尿素 NH3
脲酶
尿素分解菌
【典例】据培养基的配方表，回答下列问题：
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
培养基二
1.从物理性质看，两种培养基属于哪类？依据是什么？培养基的主要用途是什么？
固体培养基的主要用途：分离、鉴定、计数。
3.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？
可获得能分解尿素的微生物。
2.两种培养基中共有哪些成分？
碳源、氮源、水、无机盐
培养基二的碳源为_______，氮源为_______；
葡萄糖
尿素
都属于固体培养基。
依据是添加了凝固剂——琼脂
培养基二
1．(选择性必修3 P16思考·讨论)(1)如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？______________________________________________________________________。
(2)该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？___________________________________________________________________________________。
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同
2．(选择性必修3 P16思考·讨论)结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
稀释涂布平板法——将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
注意：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
微生物的选择培养
二
稀释涂布平板法
1.梯度稀释
2.涂布平板
1.梯度稀释
①铲取土样，将样品装入纸袋中
1ⅹ10
1ⅹ107
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1ⅹ105
注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌
微生物的选择培养
二
——稀释涂布平板法
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
90mL
无菌水
9mL无菌水
1mL
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：各浓度分别涂布3个平板（重复实验）
注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。
2.涂布平板
微生物的选择培养
二
——稀释涂布平板法
107
106
103
102
104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
105
1.梯度稀释
移液枪
恒温培养箱
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
3.菌落培养
微生物的选择培养
二
——稀释涂布平板法
方法 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液进行一系列的等比稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落。
接种环
涂布器
从最后划线区挑取
稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落
②用于计数
①都能分离纯化菌种 ②都在固体培养基上进行的
平板划线法 vs 稀释涂布平板法
①稀释涂布平板法
②显微镜直接计数法
微生物的数量测定
三
——间接计数法
——直接计数法
缺点：
①不能区分死菌和活菌→偏大
②不适于对运动细菌的计数。
③个体小的细菌在显微镜下难以观察。
优点：快速、直观
要求:
①选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证
获得菌落数为30-300、适于计数的平板。
②同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值；
微生物的数量测定
三
①稀释涂布平板法
缺点: 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数表示；
①分离微生物
②统计样品中活菌的数目
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
【原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。】
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
思考：如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？
每克（每ml）样品中的菌落数＝(C÷V)×M
注：C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)
M代表稀释倍数
微生物的数量测定
三
①稀释涂布平板法
——间接计数法
1．利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数。 ( )
2．培养分解尿素的细菌，培养基的pH会增大。 ( )
3．筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为液体培养基。 ( )
4．利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数( )
×
5．统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计( )
6．利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。 ( )
×
×
×
×
√
考向1| 选择培养基成分与功能的分析
1．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是(　　)
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、蒸馏水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、蒸馏水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、蒸馏水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水
A
2．物质W是一种含氮有机物，W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌，结果如下图。下列说法错误的是(　　)
A．透明圈的形成是因为W物质被分解
B．所用的选择培养基应该是以物质W为唯一氮源
C．甲菌落中的细菌可能是利用空气中的氮气作为氮源
D．乙菌落中的细菌都能降解W，不需要进一步纯化
D
乙菌落中的细菌不一定都能降解W，因此仍需要进一步纯化，D错误。
【易错提醒】能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株
原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此，能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株。
考向2| 微生物选择培养方法的辨析
3．(2022·江苏卷)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　)
A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
D
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。
4．(2022·全国乙卷)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题：
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有______________________________(答出2点即可)。
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________________；用菌株C生产S的最适碳源是____________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要______________________(答出2点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是_________________________________________________。
高压蒸汽灭菌、干热灭菌
葡萄糖
制糖废液
氮源、无机盐、水
不能合成淀粉酶
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：________________
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是___________(答出1点即可)。
配制等量的一系列不同浓度的制糖废液分别接种等量的菌株C，其他条件相同且适宜，培养一段时间后，测定不同浓度制糖废液中S产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度为生产S的最适碳源浓度
减少污染、节省原料、降低生产成本
考向3| 微生物数量测定的方法
5．某兴趣小组在校园土壤中取样，进行“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验。小明从稀释倍数为106培养基中筛选出约120个菌落，而其他同学只筛选出约40个菌落。下列有关叙述错误的是(　　)
A．小明出现这种结果的可能原因是和其他同学取样的土壤不同
B．要证明培养基是否受到污染，可将小明配制的培养基不加土样进行培养
C．当稀释倍数太小时，可能由于菌落重叠而导致计数结果偏小
D．在牛肉膏蛋白胨培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌
D
在尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若培养基变红色，可初步鉴定尿素分解菌，D错误。
6．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是(　　)
A．③号试管中的菌落稀释倍数为103倍
B．④号中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是⑤号的10倍
C．⑤号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×107个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
B
凝练学科素养·探析高考命题
02
【命题动态】针对人类生产或生活的某一需求，或结合生活或生产实例，考查微生物的营养要求，微生物的消毒与灭菌技术、微生物的选择培养、微生物分离与计数的原理及操作过程的分析。呈现形式一般以选择题为主，难度中档。
1．(2022·全国甲卷)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基 Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题：
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是___________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成________________(答出2种即可)等生物大分子。
蛋白质、DNA
石油
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________________。
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是_________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________。
在平板Ⅰ、Ⅱ的甲、乙两孔中分别滴加适量且等量的A、B菌液，在相同且适宜条件下培养一段时间，测量并比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，透明圈大则降解能力强，透明圈小则降解能力弱
N0·2n
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是________________，理由是____________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
菌株 透明圈大小 平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
A菌株
2．(2022·广东卷)研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对南中国海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
(1)研究者先制备富集培养基，然后采用_________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养，除了稀释涂布平板法，还可采用_________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以___________为碳源时生长状况最好。
高压蒸汽灭菌
平板划线
纤维素
(2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是___________________。(答一点即可)
(3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是_______________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________。
某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)
拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行
(4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有__________________________________________________________。
耐低温、耐低氧等(极端环境耐受性)
3．(2022·河北卷节选)番茄灰霉病菌严重影响番茄生产，枯草芽孢杆菌可以产生对多种病原菌具有抑制作用的蛋白质。为探究枯草芽孢杆菌能否用于番茄灰霉病的生物防治，研究者设计了相关实验。回答下列问题：
(1)检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用时，取适量____________菌液涂布于固体培养基上，将无菌滤纸片(直径5 mm)在___________菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心，数秒后取出滤纸片，培养皿倒置培养后测量__________大小以判定抑菌效果。
抑菌圈
枯草芽孢杆菌
番茄灰霉病菌
(2)枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用摇床振荡培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用_________________(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是______________________________________________________________________________________________________________________。
(3)枯草芽孢杆菌长期保藏时，常以其__________作为保藏对象。
芽孢
用稀释涂布平板法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低，而显微镜直接计数法相对准确
1．(生活、学习和实践情境)垃圾分类收集可以减少垃圾处理时间，降低处理成本。科研小组欲分离及培养若干种微生物用于对湿垃圾(包括剩菜剩饭、骨头、菜根菜叶、果皮等食品类废物)的处理。下列有关叙述正确的是(　　)
A．在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和操作者的双手进行灭菌
B．培养过程需要向培养基通入无菌空气并进行搅拌，目的是使菌体充分接触营养物质和溶解氧，促进细菌繁殖
C．科研小组若从生活垃圾中分离分解尿素的微生物，可在培养基中加入酚红指示剂，如果有尿素分解菌存在，则培养基中该菌落的周围会出现黑色
D．卫生纸类垃圾可采用焚烧的方式处理，有效减少对环境的污染
B
2．(科学实验和探究情境)穿心莲内酯为穿心莲中抗菌消炎作用的活性成分，临床上用于治疗急性菌痢、胃肠炎等。为探究不同浓度穿心莲内酯对甲、乙、丙三种痢疾杆菌的杀菌能力，某研究小组将等量的甲、乙、丙三种痢疾杆菌分别用无菌水稀释成菌悬液，在平板固体培养基上制成含菌培养皿，在培养皿上放置经不同浓度穿心莲内酯浸泡过的滤纸片，培养一段时间后，测定三种细菌的抑菌圈直径，取平均值，结果如下表。下列说法错误的是(　　)
浓度 1% 5% 10% 15% 20%
甲菌种抑菌圈直径 2.5 mm 3 mm 3.5 mm 4 mm 5 mm
乙菌种抑菌圈直径 1.6 mm 1.7 mm 1.9 mm 2.1 mm 2.5 mm
丙菌种抑菌圈直径 2.2 mm 2.7 mm 3.1 mm 3.5 mm 4 mm
A．培养皿可采用干热灭菌法进行灭菌，制备含菌培养皿时应使用稀释涂布平板法
B．不同浓度的穿心莲内酯对三种痢疾杆菌都起杀伤作用，杀菌效果乙>丙>甲
C．若长期用药，三种痢疾杆菌种群的耐药基因频率可能会增大
D．本实验还需设计在含菌培养皿上放置未用穿心莲内酯浸泡过的滤纸片作为对照
B
3．(生活、学习和实践情境)微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。下图为产油脂芽孢杆菌筛选的流程，其中B平板上的5个菌落是初筛得到的芽孢杆菌，C为B平板上菌落的原位影印，利用苏丹黑B可使脂类物质呈黑色的特性，对C进行染色，得到结果D。回答下列问题：
(1)图中对土壤菌液进行系列梯度稀释的目的是__________________
___________________________________________________________。
(2)若要使菌落能在A平板上生长，下列培养基组分中最合理的是_______(填“甲”“乙”或“丙”)，原因是____________________。
甲 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、水
乙 葡萄糖、蔗糖、NaCl、琼脂、水
丙 葡萄糖、牛肉膏、NaCl、蔗糖、水
甲　甲培养基含有细菌生长所需的各种主要营养物质和凝固剂(琼脂)
将微生物分散成单个细胞，进而获得单个的菌落
(3)培养基配制完成后需要立即进行灭菌，常用的灭菌方法为_______________________。
(4)根据D的染色结果，可判断B平板中的__________(填图中数字)是产油脂芽孢杆菌的菌落。
高压蒸汽灭菌法
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