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本节聚焦:
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
选择性必修3/第3章/基因工程/
第2节 基因工程的基本操作程序
(第二课时)
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.花粉管通道法（我国独创）：
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
③受体细胞：受精卵
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.农杆菌转化法：
指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中。
转化：
农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；农杆菌细胞内含有的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体DNA上。
原理：
利用农杆菌进行转化的思路：
将目的基因插入________________中，通过农杆菌的_______作用，就可以使目的基因________________。
Ti质粒的T-DNA
转化
进入植物细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.农杆菌转化法：
转化过程：
方法一：将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
思考：农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养。
第三步：将目的基因导入受体细胞
过程示意图：
2.农杆菌转化法：
Ti质粒
目的基因
含目的基因的重组Ti质粒
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
导入植物细胞
表现出新性状的植物
构建表达载体
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.农杆菌转化法：
第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
①两次拼接
第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
②两次导入
转基因动物用_______；原因是_____________________；导入方法____________。
第三步：将目的基因导入受体细胞
3.受体细胞的选择：
显微注射法
转基因植物用____________________________；
体细胞(叶、芽、根)或受精卵
受精卵有发育的全能性
受精卵
微生物常用__________________等；微生物作为受体细胞的优点是：_________________________________________________；导入方法 ：__________________________________________________________。
大肠杆菌、酵母菌
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
Ca2+处理使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为 ，原因是：_________________________________________。
真核细胞
分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加工
第三步：将目的基因导入受体细胞
科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
如慢病毒载体、腺病毒载体等。
课堂小结
植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化过程
项目
种类
花粉管通道法或
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
受精卵或体细胞
受精卵
原核细胞
目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
第四步：目的基因的检测与鉴定
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因；
检测目的基因是否转录出了mRNA；
目的基因是否翻译成蛋白质；
个体的抗性及抗性程度。
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
第四步：目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测
1.PCR等技术
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
将受体DNA/RNA提取出来，进行PCR扩增
基因探针
使探针与PCR扩增后的产物进行杂交，如果出现杂交带，就说明目的基因整合到受体生物的染色体DNA上或者转录出了mRNA
基因探针：
一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。
第四步：目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测
检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。
2.抗原——抗体杂交技术：
从转基因生物中提取出蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交，若出现杂交带，则表明目的基因已形成蛋白质产品。
个体生物学水平的鉴定
抗虫或抗病的接种实验；抗性以及抗性程度抗性检测，基因工程产品与天然产品的功能活性比较功能活性。
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
饲喂害虫（抗虫接种实验）
盐水浇灌
喷洒除草剂
抗虫植物：
抗病毒(菌)植物：
抗盐植物：
抗除草剂植物：
课堂小结
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上 是否插入了目的基因 PCR扩增
DNA分子杂交技术
第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR扩增
分子杂交技术
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术
个体水平 鉴定 抗虫或抗病的接种实验以及抗性程度（抗性检测） 基因工程产品与天然产品的功能活性比较（功能活性） 基因工程的基本操作程序：
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转济基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效地控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢？根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能。请你查阅资料，了解以下问题。
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对，他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
①基因策略。最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CryIAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
②田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。
③国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理：
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增：
PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合； PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。
2.琼脂糖凝胶电泳：
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷(带电粒子)。在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具：
①PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增)；
②微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所)；
③微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体)；
④一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头)；⑤电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)；
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、
模板DNA、扩增缓冲液、无菌水；
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
PCR反应体系的配方
DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤：
DNA片段的扩增：
1.用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
2.待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。
3.将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤：
4.根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀(琼脂糖用沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀)。
5.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
6.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
制备凝胶
配制琼脂糖溶液
梳子孔为加样孔，
加样孔侧连电极负极
DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤：
加样
7.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
8.将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
电泳缓冲液用来维持pH值，
使DNA带负电荷。
电泳
9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤：
观察记录
10.取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
结果分析与评价：
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
练习与应用（P83）
一、概念检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因（ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
√
×
×
练习与应用（P83）
一、概念检测
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
D
练习与应用（P83）
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用（P83）
二、拓展应用
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是______________________ ，标记基因是_____________ ，质粒pSYN 12424的作用是_________________________ 。
ctrl 基因和psy基因
Pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
二、拓展应用
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
练习与应用（P83）
不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
二、拓展应用
练习与应用（P83）
（3）请查找相关资料，了解科学家为什么要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广“黄金大米””的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。

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