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本节聚焦:
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
选择性必修3/第3章/基因工程/
第2节 基因工程的基本操作程序
(第一课时)
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？ 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
第一步：目的基因的筛选和获取;
第二步：基因表达载体的构建;
第三步：将目的基因导入受体细胞;
第四步：目的基因的检测与鉴定。
苏云金杆菌通过Bt基因编码产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
目的基因：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要指的是编码蛋白质的基因。
实例：
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
第一步：目的基因的筛选与获取
培育转基因抗虫棉用到的目的基因：Bt 抗虫蛋白基因（简称 Bt 基因）。
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫。
第一步：目的基因的筛选与获取
基因的结构
基因通常是有遗传效应的DNA片段；能编码特定的蛋白质。
放大
DNA片段
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA，
进一步编码（翻译）
出蛋白质的DNA区段。
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
基因1
基因2
基因3
原核细胞的基因结构
非编码区：
不转录，不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列。
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
启动子
终止子
连续的、不间隔的
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
编码区上游
编码区下游
间隔的、不连续的
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列
外显子
内含子
启动子
终止子
【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？
转录
初级RNA
成熟mRNA
剪切、拼接
DNA聚合酶
单链DNA
cDNA
逆转录酶
逆转录
复制
cDNA不含有非编码序列。即启动子、终止子和内含子。
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
第一步：目的基因的筛选与获取
1.筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。
制成
杀虫剂
掌握目的基因的结构
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。
掌握目的基因的功能
苏云金杆菌
防治棉花害虫
发现杀虫作用与Bt基因有关
掌握Bt基因的序列
深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)
随着测序技术的发展，以及序列数据库(GenBank)、序列比对工具(如BLAST)等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
第一步：目的基因的筛选与获取
2.利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR的概念：
DNA复制所需的基本条件：
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
（体外用高温代替）
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
（2种）
第一步：目的基因的筛选与获取
2.利用PCR获取和扩增目的基因
4种脱氧核苷酸
两条DNA母链
耐高温的DNA聚合酶(不需解旋酶，体外高温代替)
2种，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
需要一定的缓冲溶液、控制温度等
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
PCR条件：
①原料：
②模板：
③酶：
④引物：
⑤其他条件：
第一步：目的基因的筛选与获取
2.利用PCR获取和扩增目的基因
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
引物：
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物结合在模板链的3’端
第一步：目的基因的筛选与获取
2.利用PCR获取和扩增目的基因
PCR过程：
①变性：当温度上升到90℃以上时，氢键断开，双链DNA解聚为单链；
②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链(注：复性和延伸都是从子链5’—3’方向)。
④延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，如此重复循环多次。
上述过程可在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成，完成以后常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
第一步：目的基因的筛选与获取
2.利用PCR获取和扩增目的基因
用PCR可以扩增mRNA吗(教材P79)？
第一步：目的基因的筛选与获取
2.利用PCR获取和扩增目的基因
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。
难点剖析
思考：获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？
3’
5’
90℃以上，DNA双链解开；
50℃左右，引物与DNA结合。
5’
3’
5’
5’
72℃左右，新DNA合成。
3’
5’
5’
5’
第一次循环
5’
3’
5’
5’
高温变性、低温复性、中温延伸。
3’
5’
第二次循环
难点剖析
思考：获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？
高温变性、低温复性、中温延伸。
3’
5’
第三次循环
（1）子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：_____个
（2）子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个
（3）复制过程中共需引物__________个
（4）第n次复制需要引物_____个
难点剖析
思考：一个DNA，一对引物（A与B），复制n次：
2
2n-1
2n＋1-2
2n
思考：设计引物的依据是？
已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
PCR技术和细胞内DNA复制的比较
第一步：目的基因的筛选与获取
3.获取目的基因的其它方法：
通过构建基因文库来获取目的基因
人工合成目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
（2）基因文库的种类
基因组文库：
部分基因文库：
（1）什么叫基因文库
含有一种生物所有基因的文库
只含有一种生物部分基因的文库
（如：cDNA文库）
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.目的：
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代；
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。
便于重组DNA分子的筛选。
能控制表达所需要的特殊性状。
注意：目的基因必须插入到启动子与终止子之间。
DNA复制的起始位点。
启动子：
终止子：
标记基因：
目的基因：
复制原点：
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
3.基因表达载体构建的流程:
目的基因
限制酶切割位点
限制酶切割位点
质粒
复制原点
终止子
标记基因
启动子
限制酶
限制酶
获取目的基因
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
重组
DNA分子
DNA连接酶
【思考】：重组DNA分子只有这一种连接方式吗？
4.重组DNA分子的种类:
(1)单酶切法
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
目的基因
1
1’
载体
2
2’
反向连接
2
1’
1
2’
1
2
2’
1’
正向连接
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
4.重组DNA分子的种类:
(2)双酶切法
双酶切的优点:
①防止质粒重新环化；
②防止质粒与目的基因反向连接；
③防止目的基因自身环化。
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割。
知识扩展：限制酶的选择原则
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中 ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择 和 两种限制酶。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择 ，而不选择 。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。
PstⅠ
SmaⅠ
SmaⅠ
PstⅠ
PstⅠ
EcoRⅠ
训练：如图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 (　 　)
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
知识扩展：限制酶的选择原则
D
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学 成分
位置
作用
DNA片段
DNA片段
mRNA上
三个相邻碱基
mRNA上
三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA
决定转录
的结束
翻译的
起始信号
决定翻译过程的结束
比较启动子、终止子、起始密码子、终止密码子

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