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基 因 工 程
第三章
指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
基因工程
操作环境
操作对象
操作水平
原理
产物
生物体外
基因
DNA分子水平
人类需要的生物类型和生物产品
基因重组
基因工程的诞生和发展
阅读教材68~69页“科技探索之路”的内容，沿着时间顺序，了解基因工程的发展历程。
基因工程诞生的理论基础
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)DNA分子都遵循碱基互补配对原则
(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
2.为什么一种生物的基因能在另一种生物细胞内中表达？
(1)基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
3.1 重组DNA技术的基本工具
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.作用：
切割DNA分子的工具，又称限制酶。
2.来源：
(主要)原核生物
3.特点：
(1)能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列；
大多数由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
EcoR I
Sma I
5’—GAATTC— 3’
5’—CCCGGG— 3’
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3.特点：
(2)使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
G
G
A
T
C
T
T
G
A
C
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3.特点：
(2)使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
EcoR I
5'
5'
3'
3'
黏性末端
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
5’—GAATTC— 3’
3’—CTTAAG— 5’
5’—G
3’—CTTAA
AATTC— 3’
G— 5’
限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时产生的末端。
5’—AATT— 3’
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3.特点：
(2)使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
Sma I
5'
5'
3'
3'
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
5’—CCCGGG— 3’
3’—GGGCCC— 5’
5’—CCC
3’—GGG
GGG— 3’
CCC— 5’
平末端
限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时产生的末端。
思考·讨论
1.根据下列限制酶切割形成的黏性末端，回答问题：
(1)用限制酶切1个切口时，断开几个磷酸二酯键？可产生几个黏性末端？
2个
2个
思考·讨论
1.根据下列限制酶切割形成的黏性末端，回答问题：
(2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
相同
(3)不同限制酶切割产生的黏性末端一定不同吗？
不一定，可能相同
2.请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。
思考·讨论
3.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
3种
(1)细菌的DNA分子不存在这种限制酶的识别序列;
(2)限制酶的识别序列被修饰了。
(eg碱基甲基化)
当外源DNA入侵时，它会利用限制酶将外源DNA切割掉，从而保护自身的安全。
功能：
切开的黏性末端或平末端如何连接起来呢？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.概念：
将两个DNA片段连接起来的酶
2.作用部位：
磷酸二酯键
3.种类：
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端
效率相对较低
DNA连接酶和DNA聚合酶
DNA聚合酶
都是催化磷酸二酯键形成的酶。
相同点：
不同点
DNA聚合酶：
DNA连接酶：
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用：
将外源基因送入细胞中
2.种类：
质粒、噬菌体、动植物病毒等
是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的
环状双链DNA分子。
本质
最常用
在天然质粒的基础上进行人工改造
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.具备条件：
(1)具有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段插入;
(2)能在受体细胞内进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制;
(3)具有特殊的标记基因，用于筛选含重组DNA分子的细胞。
eg四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等。
【资料】标记基因的筛选原理
也可用荧光蛋白基因做标记
能够生存的，则是导入了
目的基因的受体细胞
能抵抗氨苄青霉素
(一)实验原理
四、DNA的粗提取与鉴定
1.提取原理
(1)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。
2.鉴定原理
可以初步分离DNA与蛋白质
DNA
+ 二苯胺
出现蓝色
先沸水浴
后冷却
2 mol/L溶解度最高；在0.14 mol/L溶解度最低
(二)材料用具
四、DNA的粗提取与鉴定
1.植物材料
　　新鲜的洋葱，菠菜，菜花，香蕉，草莓等。
2.动物材料
　　新鲜的猪肝等。
可选用猪血吗？
不可以，因为哺乳动物成熟
的红细胞中没有细胞核和线粒体。
(三)材料用具
四、DNA的粗提取与鉴定
3.试剂
(1)研磨液
(2)体积分数为95%的酒精
(3) 2mol/L的NaCl溶液
(4)二苯胺试剂
(5)蒸馏水
—— 析出DNA
—— 溶解DNA
—— 鉴定DNA，要现配现用
—— 稀释NaCl溶液，DNA溶解度降低，析出DNA
附录2
(四)方法步骤
四、DNA的粗提取与鉴定
充分研磨
纱布过滤
离心
取上清液
95%冷酒精
离心
白色丝状物
沉淀物
裂解细胞，释放DNA
(四)方法步骤
四、DNA的粗提取与鉴定
取2支试管
对照组:
＋ NaCl
白色丝状物或沉淀物
实验组：
不作处理
＋ 二苯胺

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