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(共38张PPT)
基因工程
的基本操作流程
第 2 节
第三章 基因工程
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因
主要指编码蛋白质的基因
Bt基因
Bt抗虫蛋白
编码
eg 苏云金杆菌
含有
(二)筛选目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(一)目的基因
一、目的基因的筛选与获取
1.人工合成
2.利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
3.从基因文库中获取
一、目的基因的筛选与获取
(三)获取目的基因的方法
1.人工合成
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。
DNA合成仪
转基因抗虫棉
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成。
2.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理：
半保留复制
(2)条件：
解旋酶
或高温
⑥缓冲液
②DNA模板
⑤2种引物
③4种脱氧核苷酸
④耐高温的DNA聚合酶
①解旋酶或高温
⑤2种引物
短单链核酸(DNA或RNA)　　　　
本质：
作用：
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸　　　　
引物连接模板链的3’端　　　　
游离的脱氧核苷酸连接在引物的3’端　　　　
注意：1种引物会导致引物与引物之间结合形成双链，不能与模板链结合。
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
引物
待扩增的DNA片段
3’
3’
(3)PCR扩增过程
变性
温度超过到90℃以上，双链DNA解旋为单链
复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(4)PCR小结
①过程：
变性
目的基因DNA受热变性后解为单链
复性
2种引物与单链相应互补序列结合
延伸
以DNA单链为模板，在耐高温的DNA聚合酶作用下延伸。即将4种脱氧核苷酸加到引物的 3’端
1个模板DNA分子经过n轮PCR，以指数形式扩增，可以扩增出约2n个DNA片段。　　　　
②结果：
(超过90℃)
(50℃左右)
(72℃左右)
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开
50℃左右，引物与DNA结合
72℃左右，新DNA合成
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
第
二次
循
环
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性、
中温延伸
低温复性、
第
三次
循
环
3’
5’
高温变性
中温延伸
低温复性
③PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因
④经过n轮复制，需要引物 个
(4)PCR小结
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开
50℃左右，引物与DNA结合
72℃左右，新DNA合成
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
第
二次
循
环
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性、
中温延伸
低温复性、
第
三次
循
环
3’
5’
高温变性
中温延伸
低温复性
③PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因
④经过n轮复制，需要引物 个
只有两条母链上没有引物
⑦常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物
2n+1-2
⑤引物不能重复利用
⑥PCR过程是先解旋，后复制
(4)PCR小结
(5)PCR技术与生物体内DNA复制的比较
《导学案》P107
3.从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
种类
基因组文库：
部分基因文库：
含有一种生物所有基因的受体菌群
只含有一种生物部分基因的受体菌群
( eg cDNA文库)
利用mRNA逆转录形成的DNA片段
二、基因表达载体的构建
1.作用
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2) 同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成
——核心步骤
目的基因
标记基因
启动子
终止子
复制原点
(2)标记基因：将含有目的基因的细胞筛选出来
(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因
2.组成
必须插入到启动子和终止子之间
eg四环素抗性基因、荧光蛋白基因等
非编码区
编码区
非编码区
启动子
终止子
转录
成熟mRNA
RNA聚合酶识别和结合位点
结束转录
原核生物基因的结构
开启转录
非编码区
编码区
非编码区
转录
前体mRNA
外显子
内含子
剪切
拼接
成熟mRNA
外显子：编码区编码蛋白质的序列
内含子：编码区不编码蛋白质的序列
真核生物基因的结构
启动子
终止子
(2)标记基因：将含有目的基因的细胞筛选出来
(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因
(5)复制原点：
DNA复制的起始位点
(4)终止子：
(3)启动子：
2.组成
必须插入到启动子和终止子之间
eg四环素抗性基因、荧光蛋白基因等
①本质：有特殊序列结构的DNA片段
②位置：基因的上游
③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
①本质：有特殊序列结构的DNA片段
②位置：基因的下游
③功能：终止转录
3.注意
(1)载体 ≠ 表达载体
表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
(2)启动子 ≠ 起始密码子；终止子 ≠ 终止密码子
位于DNA上，启动或结束转录
位于mRNA上，启动或结束翻译
(1) 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口；
(2) 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；
(3) 利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成一个重组DNA分子。
载体
基因表达载体
3.步骤
含有目的基因的DNA片段
补充：
1.单酶切缺点:
(1)质粒与目的基因反向连接；(2)质粒重新环化；
(3)目的基因自身环化。
补充：
2.双酶切优点:
(1)防止目的基因和载体自身环化；
(2)防止目的基因与载体反向连接；
三、将目的基因导入受体细胞
常用方法
导入植物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
导入动物细胞
导入微生物细胞
(一)导入植物细胞
1.花粉管通道法
②剪去柱头，滴加在花柱切面，借助花粉管通道进入胚囊。
①直接注入子房中；
(2)受体细胞：
(主要)受精卵
(1)方法：
农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
(1)原理
农杆菌细胞内含有的Ti质粒上的 T-DNA可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞的染色体DNA上。
(一)导入植物细胞
2.农杆菌转化法
(2)过程
(一)导入植物细胞
2.农杆菌转化法
(3)受体细胞：
体细胞或受精卵
(二)导入动物细胞
1.受体细胞：
2.方法：
受精卵
显微注射法
(三)导入微生物细胞
1.受体细胞：
常用原核细胞
2.方法：
一般用Ca2+处理
四、目的基因的检测与鉴定
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
PCR等技术检测
抗原 — 抗体杂交技术
抗虫鉴定
（个体水平）
分子
水平
四、目的基因的检测与鉴定
1.分子水平
(1)检测是否插入目的基因
(2)检测目的基因是否转录出mRNA
——原理：DNA分子杂交
——原理：分子杂交
PCR等
技术检测
(3)检测目的基因是否表达出蛋白质
——原理：抗原-抗体杂交
四、目的基因的检测与鉴定
2.个体水平
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒(菌)植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物
饲喂害虫(抗虫接种实验)
害虫死亡
病毒(菌)感染(抗病接种实验)
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
探究·实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
(1)利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
(2)DNA片段电泳鉴定的原理
2.方法步骤
探究·实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
(1)利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
(2)DNA片段电泳鉴定的原理
2.方法步骤
3.注意事项

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