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第一课时 微生物的基本培养技术
1.2微生物的培养技术及应用
从社会中来
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。
一般家庭自制酸奶可能会导致肠胃不适，主要原因是有杂菌混入。
那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应用无菌技术和微生物的培养技术
应该对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入
【微生物】难以用肉眼观察的微小生物的统称。
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
微生物的类群
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；
放线菌：链霉菌等
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
微生物
【菌落】分散的微生物在适宜的周体培养基表或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
沙门氏菌
毛霉
微生物
研究和应用微生物的前提（也是发酵工程的重要基础）是：
防止杂菌污染
获得纯净的微生物培养物
实验室培养微生物的条件：
①要为人们需要的微生物提供合适的___________条件；
②要确保__________________，并将需要的微生物分离出来。
营养和环境
其他微生物无法混入
培养基
分类、营养成分
防止杂菌污染
无菌技术
微生物的纯培养
配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤
孢子：某些低等动物和植物产生的一种有繁殖作用或休眠作用的细胞，离开母体后就能形成新的个体。
芽孢：是细菌休眠体。壁很厚，含水量极低，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。
菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，形成一个肉眼可见、具有一定形态结构的子细胞群体
几个名词的理解
菌落具有大小、形状、光泽度、颜色、透明度等基本特征。菌落是鉴定菌种的重要依据
细菌芽孢的结构模式图
细菌芽孢的结构模式图
几种微生物的营养和能量来源分析
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 NH4＋、NO3-等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
大肠杆菌 糖类、蛋白质 等有机物 蛋白质等 有机物
用无碳培养基可以筛选培养什么微生物？
用无氮培养基可以筛选培养什么微生物？
自养微生物
固氮微生物
本节聚焦
1.什么是培养基，如何配制？
2. 什么是无菌技术？
3.怎样进行酵母菌的纯培养？
①要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
②要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
1. _____________________________________是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物
2.在实验室培养微生物的要求:
培养基的配制
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质
培养基
概念：
作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢产物
有无 凝固剂琼脂
液体培养基
固体培养基
微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏
扩大培养、
工业生产
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
组成成分
功能
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、
分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
天然培养基
合成培养基
培养基类型
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
基本成分
碳源
氮源
水
无机盐
无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：牛肉膏、蛋白胨等
无机氮源：NH4＋、NO3-
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素等
培养基成分
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
培养乳酸杆菌需添加维生素；
培养霉菌需调至酸性；
培养细菌需调至中性或弱碱性；
培养厌氧微生物需提供无氧环境。
在主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长的条件有：对pH、特殊营养物质以及O2的需求：
无菌技术获得纯净的微生物培养物的关键是______________。防止杂菌污染防止杂菌污染的方法：①消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。②灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。无菌的范围：①实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒②培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌③实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。注意▌消毒的方法：
耐高温的液体或物品
牛奶等不耐高温的液体
无菌技术
▌消毒的方法：
皮肤、植物表面及器械消毒、 空气、地面消毒
接种室、接种箱、超净工作台
无菌技术
① 湿热灭菌
—— 高压蒸汽灭菌
100kPa、121 ℃下维持15-30min.
培养基、无菌水等
无菌技术
▌灭菌方法：
▌灭菌方法：
③ 灼烧灭菌
涂布器、接种环/针或其他金属用具 → 充分燃烧层
试管口，瓶口容易受到污染同操作。
② 干热灭菌：
160-170 ℃下加热2-3h。
耐高温的、需要保持干燥的器皿
吸管、培养皿
无菌技术
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体（如牛奶）
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
无菌方法
人们按照__________________________，配制出供其生长繁殖的营养基质，即培养基。
小结
1.概念：
微生物对营养物质的不同需求
2.作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3.类型：
固体
培养基
液体
培养基
有 无 琼脂
分离、
计数、
鉴定等
扩大培养、
工业生产
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
凝固剂
物理性质
化学成分
用途
含化学成分不明确的天然物质
培养基成分明确
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
选择培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
不能为微生物提供能量和营养
4、培养基的营养构成:
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐。
①碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
（自养微生物的碳源）
（异养微生物的碳源）
②氮源：
无机氮源：
NH4＋（铵盐）、NO3-（硝酸盐）、NH3、NH2等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。
③无机盐：
Ca、K 、Mg为 大量元素 Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素
凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。
思考：
①是否一定要加入“碳源”？
②除水以外的无机物只提供无机盐
①自养型微生物，不需要额外的加碳源
②错，如无机碳源、无机氮源
乳酸杆菌：培养基中添加维生素 霉菌：pH调至酸性
厌氧微生物：提供无氧的条件 细菌：pH调至中性或弱碱性
（2）还需满足微生物对 的需求
pH、特殊营养物质、氧气
KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2、Ca(NO3)2、NaCl、FeSO4等
（1）参与酶的组成；
（2）调节并维持细胞的渗透压；
（3）调节pH的平衡。
5.培养基的配制原则
(1)目的要明确：不同微生物需求不同，根据微生物的种类、培养目的进行配制。
(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。
(3)pH要适宜：不同微生物适宜生长的pH范围不同，可在培养基中添加缓冲剂维持pH稳定。　　　
【基础过关】
(1)所有的培养基中都要加入琼脂。( )
(2)是碳源的物质不可能同时是氮源 。( )
(3)培养霉菌时一般需将培养基调至碱性。( )
(4)培养厌氧型微生物时，除需要提供无机碳源之外，还需要提供无氧的条件。( )
×
×
×
×
(5)凡碳源都提供能量。（ ）
(6)除水以外的无机物只提供无机盐。（ ）
(7)无机氮源也可能提供能量。（ ）
(8)培养基只能用于培养微生物。（ ）
×
×
√
×
对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如牛肉膏
提示：培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件，其碳源的类型要看其同化作用类型，若为自养型则需要提供无机碳源，若为异养型则需要提供有机碳源。
自然界中一些微生物如硝化细菌，可以以无机氮源合成细胞物质，同时通过氧化外界无机物获得生长所需能量，叫做化能合成作用
(9)病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活。目前不能利用人工培养基来培养病毒，只有接种在活细胞或组织中，病毒才能增殖。（ ）
√
传统发酵通常直接利用原材料中天然酵母菌
工业生产通常使用人工选育的高活性酿酒酵母
如何获得纯种酵母菌？
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体成为培养物；
纯培养的步骤包括：
配制培养基、灭菌、接种、分离和培养
微生物的纯培养
培养物：
纯培养物、纯培养：
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
酵母菌的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
菌落
特征：
大小、形状、隆起程度、颜色等。
功能：
鉴定菌种的重要依据
获得单菌落的方法：
平板划线法、稀释涂布平板法
不同菌落的颜色与形状
方法步骤
1.制备培养基
配制培养基 称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
倒平板 待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
1
2
3
4
（1）拔出锥形瓶的棉塞
（2）将瓶口迅速通过火焰
（3）用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10-20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖
（4）等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
倒平板的具体步骤
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
既可以防止培养基表面的水分挥发；
又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
思考
2.接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
原理：
“平板划线”实验操作
连续划线法
分区划线法
1.灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
2.在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
3.试管口通过火焰
4.在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
5.试管口通过火焰，并塞上棉塞
6.将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
“平板划线”实验操作
重复实验：
划3个平板
空白对照：
1个不划线
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
注意：
为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
思考：
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物
3.培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24-48 h。
思考：
为什么要同时放入未接种的平板？
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
下列为几位同学描述的平板划线接种法的划线方式，其中正确的是（ ）
A.
B.
C.
D.
C
试一试
1.2微生物的培养技术及应用
高压蒸汽灭菌
液体培养基
二 微生物的选择培养与计数
微生物的培养技术及应用
--微生物的选择培养和计数
01
选择培养基
培养物
纯培养物
纯培养
将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
过程
配制培养基→灭菌→接种→分离→培养
菌落
如何从自然界中分离出需要的特定微生物？
01
选择培养基
美国黄石国家公园
水生栖热菌(Thermus aquaticus)
耐高温DNA聚合酶
提取
用于
聚合酶链式反应
体外DNA扩增
01
选择培养基
筛选原理：
水生栖热菌能在70~80℃高温条件下生存，而其他多数微生物不能生存
70℃ 大肠杆菌
70℃ 栖热菌
80℃ 栖热菌
100℃ 栖热菌
人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
选择培养基配方的设计
思考·讨论
★选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长的培养基，称为选择培养基。(教材P16黑体字)
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素为，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。
CO(NH2)2 + H2O
CO2 + 2NH3
脲酶
转化
NH4+
NO3-
01
选择培养基
选择培养基配方的设计
思考·讨论
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素为，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。
讨论1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基，以尿素作为唯一氮源，只允许以尿素作为氮源的微生物生长。
讨论2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
01
选择培养基
01
选择培养基
★选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长的培养基，称为选择培养基。(教材P16黑体字)
温度
提供70~80℃的培养温度
筛选出水生栖热菌
营养
筛选出石油分解菌
只提供石油为唯一碳源
营养
筛选出纤维素分解菌
只提供纤维素为唯一碳源
pH
选出耐高pH的细菌
提供高pH的生存环境
氧气
筛选出厌氧细菌
不提供氧气的生存环境
01
选择培养基
★选择培养基
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
葡萄糖做碳源
苯乙醇做碳源
选择培养基
在培养基中加入分离对象“嗜好”的营养物质。
①投其所好
在培养基中加入分离对象对能够抵抗的某种抗菌物质。
②取其所抗
02
微生物的选择培养
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素为，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。
选择培养基配方的设计
思考·讨论
1g土壤中含有多少能分解尿素的细菌？
选择培养基
稀释涂布平板法
单菌落
+
→
02
微生物的选择培养
稀释涂布平板法
1×10
90mL无菌水
2
铲取土样，将样品装入纸袋中。
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀
1
2
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中
02
微生物的选择培养
稀释涂布平板法
2
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
02
微生物的选择培养
稀释涂布平板法
02
微生物的选择培养
稀释涂布平板法
待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落
培养：
7
02
微生物的选择培养
获得单菌落的方法
平板划线法
稀释涂布平板法
稀释涂布平板法除了可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
02
微生物的选择培养
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具
原理
特点
结果
共同点 接种环
涂布器
在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落
方法简单，但不适宜计数
单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂
使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
显微镜直接计数法
间接计数法
直接计数法
二、微生物的选择培养
方法1
稀释涂布平板计数法计数
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
一般选择菌落数在30-300的平板进行记数。
统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。
因此，统计结果一般用菌落数而不用活菌数来表示。
同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
★原理：
★原则：
减小实验误差
★注意：
④数量测定
方法：稀释涂布平板法
2.微生物的选择培养
间接计数法
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
A
④数量测定
方法：稀释涂布平板法
2.微生物的选择培养
间接计数法
计数原则:
B
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
1.选择多少个菌落的平板进行计数？
2.每个稀释浓度能否只取一个平板，为什么？
3统计的菌落数往往比活菌数少？为什么？
4.你认为成功的关键在于什么？
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
④数量测定
方法：稀释涂布平板法
2.微生物的选择培养
间接计数法
C
如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？
公式进行计算。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，
M代表稀释倍数。
例1.两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
微生物的数量测定
方法2
显微镜直接计数法
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
快速、直观，能观察微生物的形态特征。
★原理：
★特点：
不能区分死菌和活菌，统计结果一般是活菌数和死菌数的总和
血细胞计数板--------真核细胞的计数
细菌计数板-------对细菌（原核细胞）
血细胞计数板和细菌计数板有没有何别？
显微镜直接计数法
血细胞计数板和细菌计数板
方法2：显微镜直接计数法
2.微生物的选择培养
直接计数法
原理
抽样检测的方法：
①先将盖玻片放在血细胞计数板的计数室上，用吸管吸取培养液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行渗入。
②多余的培养液用滤纸吸去。
③稍待片刻，待酵母菌全部沉降到计数室底部；将计数板放在载物台的中央；
④计数一个小方格内的酵母菌数量，在以此为根据估算酵母菌数量
补充：
（1）血细胞计数板构造
计数室
1mm
大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，
即1mm×1mm×0.1mm，其容积为0.1mm3；
血细胞计数板构造及其使用方法
计数池（2个）
16×25型：即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格
25×16型： 即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格
每一大方格都是由16×25 = 25×16 = 400个小方格组成
（2）血细胞计数板的规格
(1)16格×25格的血球计数板计算公式
酵母细胞数/ml=(100小格内酵母细胞个数/100)×400×稀释倍数/10-4
即(100小格内酵母细胞个数/100)×4×106×稀释倍数
(2)25格×16格的血球计数板计算公式:
酵母细胞数/ml=(80小格内酵母细胞个数/80)×400×稀释倍数/10-4
即(80小格内酵母细胞个数/80)×4×106×稀释倍数
计算方法
每毫升原液所含酵母菌数：每小格平均酵母数╳400╳104 ╳稀释倍数
它们的区别就是计数室的高度不同，血细胞计数板计数室的高度是0.1 mm 。
故计算是：
血细胞计数板
方法2：显微镜直接计数法
2.微生物的选择培养
直接计数法
显微镜直接计数法（计数板计数法）
原理
酵母菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
×稀释倍数
1×10-4
细菌计数板计数室的高度是0.02 mm。
故细菌计数板计数细菌的计算是：
细菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
2×10-5
×稀释倍数
0.02mm3=0.02×10-3cm3=2×10-5mL
细菌计数板
方法2：显微镜直接计数法
2.微生物的选择培养
直接计数法
显微镜直接计数法（计数板计数法）
原理
③一般情况下，计数所得种群数量，比实际值大还是小？为什么？
会比实际要大。因为在计数所得的数据包含了死菌和活菌。
如何克服以上难题？
区分死菌和活菌。可采用台盼蓝对酵母菌进行染色。能被染成蓝色的则为死菌，不能被染色的则是活菌。在此条件下，计数酵母菌时，只需计数不被染色的酵母菌。
方法2：显微镜直接计数法
2.微生物的选择培养
直接计数法
对稀释涂布平板法和显微镜直接计数法进行比较
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、_____________ 　　　　　　 等 培养基等
计数依据 菌株本身 培养基上的　 　数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差
血细胞计数板
或细菌计数板
菌落
微生物的计数方法比较
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具
计数依据
优点
缺点
计算公式
显微镜、细菌计数板或血细胞计数板
涂布器
细菌个数
培养基上菌落数
计数方便、操作简单
计数的是活菌
不能区分死菌与活菌
操作较复杂且有一定误差
每毫升原液含菌株数＝400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数
每毫升原液含菌株数＝
平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数
（1）实验目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
（2）实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分离尿素的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
探究 实践
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）实验步骤
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
①提供无机盐；
②调节pH。
①培养基的制备
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
②土壤取样
（3）实验步骤
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
A 取样地点要求：
B 取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
测放线菌：一般用103、104、105稀释液。
测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
③样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
（3）实验步骤
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
B
A
C
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；
例如可以将1×103-1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30-300的平板进行计算。
思考2:
③样品的稀释与涂布平板
（3）实验步骤
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
③样品的稀释与涂布平板
（3）实验步骤
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
思考：
1.如何判断选择培养基是否具有选择作用？
2.如何判断培养基是否被污染？
需要将菌液涂布在
牛肉膏蛋白胨基本培养基上
将空白培养基和接种培养
基同时培养
培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
④微生物的培养与观察
（3）实验步骤
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
A
B
C
一般来说，在相同的培养条件下
，同种微生物表现出稳定的菌落
特征，如形状、大小和颜色等。
说出以下现象对应的结果分析。
现象 分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数木
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
⑤结果分析与评价
（3）实验步骤
4.进行
实验
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。
5.进一
步探究
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
鉴别培养基
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,
用以鉴别不同种类的微生物的培养基。
思考： 1.如何对尿素分解菌进行鉴定？
氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断
在培养基中加入酚红指示剂
结果：
酚红指示剂变红，说明是尿素分解菌
脲酶阴性
脲酶阳性
若为固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越 。
强
名称 主要用途 特征性变化
伊红-亚甲蓝 琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 出现带金属光泽的深紫色菌落
刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 纤维素被分解后出现透明圈
其他鉴别培养基实例：
微生物的数量测定
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究·实践
讨论1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落？
对照的培养皿没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
接种后的牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落明显多于选择培养基的菌落数，说明培养基筛选出了一些尿素分解菌。
讨论2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果得到了两个或多个菌落数为30~300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
讨论3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异大，可能是什么原因引起的？
如果用同一土样进行操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
课后习题
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
(1)这种培养基是一种选择培养基。（ ）
(2)利用这种石油降解菌可以降解石油,修复土壤。（ ）
(3)相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A.菌落中的细菌数目是固定的
B.平板上的一个菌落就是一个细菌数目相同
C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际
D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
课后习题
1.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官—瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。瘤胃中的微生物多为厌氧微生物，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
课后习题
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨,其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用,使人们能够利用秸秆等生产酒精,用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料,它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时,刚果红与纤维素形成红色复合物;而当纤维素被纤维素分解菌分解后,复合物就无法形成,培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈
课后习题
几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈
(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
(2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌 为什么
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中,采集土样时,可以选择纤维素丰富的环境,如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
(3)有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分

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