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第一讲 微生物的培养与利用、分离与计数
知识点一　微生物的实验室培养
1．培养基的成分和分类
(1)
(2)分类
2．连线无菌技术的类型、方法及对象
3．纯化大肠杆菌
(1)制备固体培养基的流程：
(2)纯化方法
知识点二　土壤中分解尿素细菌的分离和计数
(1)菌种筛选：使用尿素是唯一氮源的选择培养基培养。
(2)统计菌落数目：常用方法有稀释涂布平板法、显微镜直接计数法。
(3)细菌分离与计数的实验流程：土壤取样→配制培养基→微生物的培养与观察→细菌的计数。
知识点三　分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素酶
(1)组成：一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
(2)作用：纤维素纤维二糖葡萄糖。
2．筛选方法
(1)方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
(2)培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
3．实验流程
：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量
挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈
一、理解运用能力
判断下列叙述的正误。
(1)根据物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型(×)
(2)培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分(√)
(3)在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及特殊营养物质的需求(√)
(4)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(√)
(5)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源(√)
(6)统计样品中的活菌一般用平板划线法(×)
(7)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌(×)
(8)刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物(√)
(9)纤维素酶只包括三种组分：C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶(×)
(10)筛选分解纤维素的微生物的培养基中是以纤维素为唯一碳源的选择培养基(√)
二、图表分析能力
下表为筛选分解尿素细菌的培养基，据此回答问题：
KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素琼脂 1.4 g2．1 g0．2 g10．0 g1．0 g15．0 g
将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL
(1)在该培养基中尿素的作用是什么？琼脂的作用是什么？
答案：尿素作唯一氮源，起选择作用；琼脂作为凝固剂，用于制备固体培养基。
(2)对筛选出的细菌要进行进一步的鉴定，如何鉴定？
答案：在培养基中再加入酚红指示剂，培养细菌后，pH升高，指示剂将变红。
[理清脉络]
考点一|培养基及微生物的纯化培养技术
1．培养基的种类
(1)按物理状态分类：
培养基种类 特点 用途
液体培养基 不加凝固剂 工业生产
固体培养基 加凝固剂(如琼脂) 微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
(2)按功能分类：
种类 制备方法 原理 用途 举例
选择培养基 培养基中加入某些化学物质 依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计　　 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌　
鉴别培养基 培养基中加入某种指示剂或化学药品 产生特定的颜色或其他变化　　　 鉴别不同种类的微生物　　 用伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌　
　　2.微生物的纯化培养
方法 平板划线法 稀释涂布平板法
注意事项 (1)接种环的灼烧：①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物②每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端③划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者(2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种(3)划线时最后一区域不要与第一区域相连(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破 (1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处(2)涂布平板时：①涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体
　　[典例1]　(2014·乐山测试)下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是(　　)
A．在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌
B．划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上
C．接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的
D．第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数
[解析]　在每次划线前后都要对接种环进行 ( http: / / www.21cnjy.com )灭菌；进行划线操作时，左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；第1区和第5区的划线不能相连。
[答案]　C
1．消毒和灭菌的辨析
条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具
干热灭菌法 玻璃器皿、金属工具
高压蒸汽灭菌法 培养基及容器的灭菌
2．并非所有生物所需的营养物质都相同
(1)微生物需要的营养成分有水、无机盐、碳源、氮源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。
(2)在人和动物中，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。
(3)在植物中，营养物质包括矿质元素、水、二氧化碳三类。
[针对练习]
高考命题常从以下角度设置陷阱
(1)从各种相近的选项中直接筛选消毒或灭菌的方法。(2)给定操作对象，据此选择合适的消毒、灭菌方法。
1．除了高温加热以外，其他灭菌方法还有(　　)
A．紫外线照射　　　　　　B．真空包装
C．用保鲜膜密闭 D．添加防腐剂
解析：选A　灭菌是使用强烈的理化因素杀死物 ( http: / / www.21cnjy.com )体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。真空包装、添加防腐剂、用保鲜膜密闭都只起到了抑菌作用，而紫外线照射使细菌的蛋白质变性，核酸受破坏，是灭菌方法。
2．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌(　　)
A．接种环、手、培养基 B．高压锅、手、接种环
C．培养基、手、接种环 D．接种环、手、高压锅
解析：选C　一般说来灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手臂需要消毒处理。高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。
考点二|微生物的筛选与计数
1．筛选菌株
(1)原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)菌株筛选原理的比较：
土壤中分解尿素的细菌 分解纤维素的微生物
①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂， 若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素 ①选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源②鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
　　2.统计菌落数目的方法
(1)显微镜直接计数法：
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②方法：用计数板计数。
③缺点：不能区分死菌与活菌。
(2)间接计数法(活菌计数法)：
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面 ( http: / / www.21cnjy.com )生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌 ( http: / / www.21cnjy.com )株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 的平板进行计数。
[典例2]　(2014·达州质检)利用 ( http: / / www.21cnjy.com )农作物秸秆为原料可生产乙醇，生产过程中可采用微生物将秸秆水解或用酶水解，其主要技术流程如下图所示，下列相关说法错误的是(　　)
秸秆秸秆碎屑反应罐水解压滤出渣
酒精发酵真空分馏
A．可用刚果红染色法筛选过程①所需的纤维素分解菌
B．过程①加入的纤维素酶是葡萄糖苷酶
C．酒精发酵接种的酵母菌需在无氧条件下发酵
D．酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌
[解析]　筛选纤维素分解菌可采用刚 ( http: / / www.21cnjy.com )果红染色法；纤维素酶为复合酶，至少包含三种组分，C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶；酒精发酵需在无氧条件下进行；酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌。
[答案]　B
1．分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，因为菌落只能在固体培养基上形成。
2．平板划线法只适合用于微生物的提纯，不适合进行计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。
3．分离能分解纤维素的微生物时，有时需要进行选择培养，选择培养的目的是增大选择对象在样液中的浓度，以确保用刚果红染色法鉴别时确实能得到所需菌种。
选择培养基的应用
(1)选择培养基在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。目的是培养、分离出特定微生物。
(2)选择培养基应用实例：
①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
③培养基中缺乏氮源时，可以分离得到固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。
④当培养基的某种营养成分为特定化学 ( http: / / www.21cnjy.com )成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。
⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。
[针对练习]
3．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分 ( http: / / www.21cnjy.com )离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出(　　)
①大肠杆菌　②霉菌　③放线菌　④固氮细菌
A．④②③　　　　　　　 B．①②③
C．①③④ D．只有③④
解析：选A　缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，而固氮细菌能生长；在培养基中加青霉素可以抑制细菌和放线菌等原核生物细胞壁的合成，而霉菌属于真核生物，故能生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，对放线菌的生长无影响。
[课堂对点练]
题组一　微生物的培养和纯化
1．(2013·江苏高考)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是(　　)
A．培养基分装到培养皿后进行灭菌
B．转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线
C．接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养
D．培养过程中每隔一周观察一次
解析：选B　培养微生物过程中应先灭菌再倒平板；每一次划线前都要进行接种环的灼烧灭菌；接种后的培养皿应在恒温培养箱中进行培养，光照会影响温度等条件；培养过程中观察间隔的时间一般不超过24 h。
2．(2012·北京高考)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是(　　)
A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中
B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上
C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上
D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上
解析：选C　将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中进行酿酒时，在缺氧、酸性环境下其他杂菌不能生长，故不严格灭菌对其影响不大；腐乳制作中将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上，毛霉生长繁殖快且抗杂菌能力强，故不严格灭菌对实验结果影响不大；进行植物组织培养时，植物材料体积小、抗性差，而微生物繁殖快、生长迅速、会争夺培养基中的营养，产生的代谢废物还会毒害培养材料，故培养材料一旦被微生物(如细菌)污染，将严重影响实验结果；选择培养基中已经加入了某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物生长，另外土壤浸出液本身也含有一定量的微生物，因此将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上时不进行严格的无菌操作，对实验结果影响不大。
题组二　微生物的筛选与计数
3．(2013·安徽高考)下图为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是(　　)
A．根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目
B．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
C．重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接
D．放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置
解析：选D　读图可知，接种 ( http: / / www.21cnjy.com )该微生物所用的方法是稀释涂布平板法，而通过该方法只能估算样品中含有的活菌数；外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行表达，而不是复制；重组质粒与探针之间的杂交原理是碱基互补配对；放射自显影结果显示的杂交链位置与原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置相同。
4．(2013·课标卷Ⅱ ( http: / / www.21cnjy.com ))临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：
(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用________法或________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。
(2)取该单菌落适当稀释，用________法接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。
(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B__________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明__________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的________。
(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好选用抗生素________。
解析：(1)微生物的常用接种方法为划线 ( http: / / www.21cnjy.com )法和稀释涂布法。(2)能够使菌落均匀生长、布满平板的接种方法为涂布法。(3)含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A敏感；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B不敏感；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明该致病菌对C的敏感性比对A的弱；含D的滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落(排除杂菌污染)，说明该致病菌可能对抗生素D产生了抗药性。
答案：(1)划线　稀释涂布(或涂布)　(2)涂布　(3)敏感　不敏感　该致病菌对C的敏感性比对A的弱　耐药菌　(4)A
[课下提能练]
一、选择题
1．下列关于灭菌和消毒的说法不正确的是(　　)
A．灭菌是指杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
B．消毒和灭菌的条件、结果、方法是相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等
解析：选B　灭菌是指杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，消毒只能杀死部分微生物，不能杀死芽孢和孢子。
2．能够测定样品活菌数的方法是(　　)
A．稀释涂布平板法　　　　　　 B．直接计数法
C．质量法 D．比浊法
解析：选A　直接计数法是利用特定的计数 ( http: / / www.21cnjy.com )板，在显微镜下计算一定容积量样品中微生物的数量，不能区分死菌与活菌；质量法是用于微生物生长测定的一种方法，有湿重法和干重法，也可以通过测蛋白质和DNA含量反映细胞的物质质量；比浊法是在一定范围内，悬液中细胞浓度与浑浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大；活菌在适宜培养基和良好生长条件下通过生长形成菌落，此法又称活菌计数法，可采用稀释涂布平板法接种。
3．下列关于分离纤维素分解菌的实验操作有误的是(　　)
A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．选择培养这一步可省略，但得到的纤维素分解菌会较少
C．可通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量
D．对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到不含纤维素的培养基上
解析：选A　经选择培养后，需经稀释后才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。
4．(2014·广元质检)分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(　　)
选项 尿素 琼脂糖 葡萄糖 硝酸盐
A ＋ ＋ ＋ ＋
B － － － －
C ＋ ＋ ＋ －
D ＋ － － ＋
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
解析：选C　分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且尿素作为唯一的氮源，不能添加硝酸盐。
5．下列关于微生物培养基的叙述，错误的是(　　)
A．制备固体培养基，可以在液体培养基中加入凝固剂琼脂
B．微生物在固体培养基表面生长形成的菌落，可以用肉眼观察到
C．所有培养基都含有相同的水、碳源、氮源和无机盐等四类物质
D．培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素
解析：选C　微生物在固体培养基上生长，可以形成肉眼可见的菌落；培养不同的微生物，所需配方存在差异；培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素。
6．使用液体选择培养基培养纤维素分解菌的目的是(　　)
①用液体选择培养基可获得大量纤维素 ( http: / / www.21cnjy.com )分解菌　②用液体培养基便于稀释涂布平板　③纤维素分解菌只能在液体培养基中生长　④用液体培养基可鉴别纤维素分解菌
A．①② B．①③
C．②④ D．③④
解析：选A　使用液体选择培养基培养纤维素 ( http: / / www.21cnjy.com )分解菌，一方面可以获得大量纤维素分解菌，另一方面便于稀释涂布平板。纤维素分解菌也可以在固体培养基上生长；鉴别纤维素分解菌使用的是固体培养基。
7．研究者从冰川土样中分离获得了具有较高脂肪酶活性的青霉菌菌株，为了在此基础上获得脂肪酶活性更高的菌株，最可行的做法是(　　)
A．用紫外线照射青霉菌菌株，再进行筛选
B．将青霉菌菌株与能高效水解蛋白质的菌株混合培养，再进行筛选
C．将能高效水解蛋白质的菌株的基因导入青霉菌菌株，再进行筛选
D．设置培养基中各种营养成分的浓度梯度，对青霉菌菌株分别培养，再进行筛选
解析：选A　基因突变是不定向的，紫外线处理后再进行筛选有可能获得脂肪酶活性更高的菌株。
8．大多数微生物的扩大培养，利用的都是牛肉膏蛋白胨固体培养基。下表所示牛肉膏蛋白胨培养基的成分及含量。相关叙述错误的是(　　)
成分 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂 蒸馏水
含量 5 g 10 g 5 g 20 g 1 000 mL(定容体积)
A．该培养基为微生物提供维生素的有牛肉膏、蛋白胨
B．该培养基为微生物提供氮源的有牛肉膏、蛋白胨
C．该培养基为微生物提供碳源的有牛肉膏、蛋白胨
D．该培养基能为微生物提供无机盐的只有NaCl
解析：选D　牛肉膏为微生物提供碳源、氮源、维生素以及磷酸盐等，其中磷酸盐属于无机盐。
二、非选择题
9．(2014·南充模考)下面是分离分解尿素的细菌所用的培养基配方：
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 蒸馏水
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 定容至1 000 mL
请根据以上配方，回答下列问题：
(1)该培养基含有微生物所需要的________类营养物质。其中最主要的碳源是________，氮源是________。
(2)该培养基按物理性质划分是________培养基；按培养基的作用划分是________培养基。
(3)该培养基具有选择作用的原因是___________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)在该培养基中，可通过检测pH的变化来判断尿素是否被分解，依据的原理是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
所用方法是在培养基中加入________指示剂，如果尿素被分解，则培养基变成________色。
解析：(1)该培养基中含有碳源、氮源、水和无机盐四类营养物质，葡萄糖是最主要的碳源，尿素是氮源。(2)由于有凝固剂琼脂的存在，该培养基属于固体培养基。(3)由于尿素是该培养基的唯一氮源，只有能分解尿素的微生物才能生长，因此该培养基属于选择培养基。(4)尿素被分解可产生氨，氨能使酚红指示剂变成红色，据此可推测培养基中的尿素是否被分解。
答案：(1)4　葡萄糖　尿素　 ( http: / / www.21cnjy.com )(2)固体　选择　(3)该培养基中唯一的氮源是尿素，只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长和繁殖　(4)在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高　酚红　红
10．(2014·陕西五校一模)下面的甲图表示酵母菌、硝化细菌和乳酸菌在半固体培养基中的生长情况，乙图表示这三种菌的增殖速度与氧气浓度之间的关系，请据图回答：
(1)乙图中a、b、c三条曲线依次表示甲图________号试管中微生物在不同氧气浓度中的增殖速度。
(2)研究发现，青霉素能破坏细菌的细胞 ( http: / / www.21cnjy.com )壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用。如果培养基中混杂了这三类微生物，请设计实验，利用改变培养基成分等培养条件，将酵母菌和硝化细菌分离出来。
①主要步骤：
a．分别配制不含________的培养基(A)和加入________的培养基(B)，分别灭菌。
b．分别接种混合液放在适宜条件下培养。
c．观察结果。
②结果：在A培养基上生存的是________，在B培养基上生存的是________。
(3)微生物培养过程中，获得纯净培养物的关键是________________________________。
(4)若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是________________。
解析：从甲图试管中微生物的分布和数量分析， ( http: / / www.21cnjy.com )乳酸菌分布在缺氧的下层，酵母菌在缺氧的底部和氧含量高的上层均匀分布，而硝化细菌主要分布在上层，因此可以判断出a、b、c曲线表示3、2、1号试管中的微生物增殖速度。青霉素破坏细菌的细胞壁，而酵母菌属于真菌，青霉素不能起到杀灭的作用，硝化细菌属于自养生物，不需要添加葡萄糖作为能源物质和碳源。
答案：(1)3、2、1　(2)①有机碳源　青霉素　②硝化细菌　酵母菌　(3)防止杂菌污染(无菌技术)　(4)稀释涂布平板法
11．根据有关微生物的知识，分析回答问题：
(1)当水体过于纯净时，硝化细菌会形成休眠体，这种休眠体被称为________。
(2)对于混有硝化细菌、蓝细 ( http: / / www.21cnjy.com )菌和大肠杆菌的悬浮液，可利用选择培养基进行微生物筛选。筛选硝化细菌的培养基成分包括____________________(供选：葡萄糖、纤维素、牛肉膏、(NH4)2SO4、KNO3、无机盐、琼脂、伊红美蓝染料、H2O)，制备培养基时，灭菌与调pH的先后顺序是____________________。
(3)如利用上述培养基筛选大肠杆菌菌落，则应另外添加的成分是__________________，菌落特征为________。
(4)将采自养殖池中的水样1 mL稀释 ( http: / / www.21cnjy.com )100倍，然后吸取稀释后的水样1 mL，接种于上述硝化细菌选择培养基上培养，接种所使用的工具是________。一段时间后观察菌落并计数，实验重复三次结果如图所示。该养殖池每毫升水含有硝化细菌________个。
解析：硝化细菌属于自养生物，能通过化能 ( http: / / www.21cnjy.com )合成作用合成糖类，因此不用添加碳源葡萄糖和纤维素。制备培养基时，要先调节pH，再灭菌。大肠杆菌属于异养生物，培养基中需要添加葡萄糖，还应添加伊红美蓝染料染色。稀释100倍后的三次实验的培养基中菌落的平均数是8，因此在稀释前的每毫升水中含有800个硝化细菌。
答案：(1)芽孢　(2)(NH4)2SO ( http: / / www.21cnjy.com )4、无机盐、琼脂、H2O　先调pH再灭菌　(3)葡萄糖、伊红美蓝染料　呈现黑色　(4)涂布器　800
12．(2013·四川高考)普通酵母菌直接利 ( http: / / www.21cnjy.com )用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α 淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种(过程如图甲所示)。
(1)图甲中，过程①需要的酶有___ ( http: / / www.21cnjy.com )___________________。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以__________作为唯一碳源。②、③过程需重复几次，目的是_________________。
(2)某同学尝试过程③的操作，其中一个 ( http: / / www.21cnjy.com )平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是________________________________________________________________
____________________；推测该同学接种时可能的操作失误是_____________________。
(3)以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵 ( http: / / www.21cnjy.com )母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种______________菌的发酵罐需要先排气，其原因是__________________________________
____________________________。
(4)用凝胶色谱法分离α 淀粉酶时，在色谱柱中移动速度较慢的蛋白质，相对分子质量较________。
解析：(1)由题目所给信息可以直接看出，工程酵母菌比普通酵母菌利用淀粉的能力强。在以淀粉为唯一碳源的培养基上，工程酵母菌可以正常增殖，而普通酵母菌不能正常增殖。(2)微生物接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，根据图乙菌落分布情况可确定该同学的接种方法是后者；由图乙中菌落过于集中可推测该同学接种时可能的操作失误是涂布不均匀。(3)在以淀粉为原料的培养液中，普通酵母菌繁殖慢，产生气体少；工程酵母菌繁殖快，产生气体多。(4)当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的蛋白质不易进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。
答案：(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶　淀粉　进一步筛选纯化获得分解淀粉能力强的酵母菌
(2)稀释涂布平板法　涂布不均匀
(3)工程酵母　工程酵母菌分解淀粉产生葡萄糖的能力强，导致酒精发酵产生CO2的速率更快　(4)小

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