资源简介

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单克隆抗体等
动物细胞工程常用的技术
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
是其他动物细胞工程技术的基础。
2.2 动物细胞工程
为什么要进行动物细胞培养
2.2.1 动物细胞培养和核移植技术
社会背景
女团SNH48成员唐安琪3月1日发生火烧身意外，全身80%烧伤
大面积烧伤，只能用用人造皮肤进行人工植皮
从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
动物细胞培养定义
一、动物细胞培养
分散
单个细胞
适宜的培养基
生长和增殖
探究点一、动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
1、普通教室里头培养动物细胞会怎样？
2、培养条件？
3、美国生物学家哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，可推断培养基成分应该有什么？
4、还需要什么条件？
5、我的总结
探究点一、动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
1、普通教室里头培养动物细胞会怎样？
2、培养条件pH、温度？如何调节？
3、美国生物学家哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，可推断培养基成分应该有什么？
细菌多，易污染培养基
pH：7.2--7.4;哺乳动物温度：36.5±0.5℃
思考方向：模拟体内生长环境或与细胞内成分相同（淋巴液成分：水、无机盐、少量蛋白质、葡萄糖等）
合成培养基+天然成分（血清、血浆）。
血清来源：培养人的细胞，用人的血清，不好获取，胎牛血清。
探究点一、动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
4、还需要什么气体条件？各气体的作用
5、我的总结
主要是CO2和O2，比例：95%空气+5%CO2。 CO2和O2作用分别是调解pH值和细胞呼吸的原料。
无菌、无毒的环境
除必要成分还需要添加血清。
pH：7.2--7.4，通过CO2调节，温度：36.5±0.5℃
O2呼吸作用的原料，CO2调节pH
探究点二、动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
2、动物细胞培养选择什么材料？
3、为什么要分散成单个细胞？
4、选用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的连接物质主要是什么成分？你还能用什么酶去分散细胞？
5、培养中的细胞会在哪里生长，细胞层分几层？
6、什么是原代培养和传代培养？
7、要研究细胞的正常功能选择怎样的细胞？
1、与植物组织培养比较,动物细胞培养的结果？
探究点二、动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
2、动物细胞培养选择什么材料？
3、为什么要分散成单个细胞？
4、选用胰蛋白酶分散细胞，说明动物细胞间的连接物质主要是什么成分？你还能用什么酶去分散细胞？
1、与植物组织培养比较,动物细胞培养的结果？
细胞生长（体积增大）和数量增多。
胚胎或幼龄动物的组织器官/ 干细胞。
脱离原有环境对生长和繁殖的限制；充分吸收营养；排除代谢废物。
动物细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官
探究点二、动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
5、培养中的细胞会在哪里生长，细胞层分几层？
细胞贴壁生长，会出现接触抑制，单层
细胞贴壁过程
接触抑制
失去接触抑制
无限增殖
7、要研究细胞的正常功能选择怎样的细胞？
6、什么是原代培养和传代培养？
探究点二、动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。
贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增值，这种分瓶培养称为传代培养。
培养10代以内的保持正常的二倍体核型的细胞。
动物细胞培养的简单过程
分离组织（胚胎、幼体）
分散细胞（胰蛋白酶）
原代培养（细胞增殖）
传代培养（细胞增殖）
分装
一、动物细胞培养
传代培养中
1-10代：正常二倍体核型
11-50代：核型可能变化甚至出现不死性（克服寿命的自然极限）。
牛刀小试
动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。
Q1 可否用胃蛋白酶来来分散细胞？
Q2 下图培养基的颜色为啥是红色？
添加了酸碱指示剂（常用酚红，碱性--红，酸性--黄），可以通过颜色变化及时判断是否被污染，污染之后会显示黄色。
Q3 那培养基是如何控制pH值的？
通过调节培养箱中CO2的浓度来实现。
探究点三、动物细胞培养技术的应用
一、动物细胞培养
2、培养基因工程等的受体细胞
3、检测有毒物质
4、生理、病理、药理的研究
1、生产生物制品
测定某物质的毒性，提供的材料有正常培养的细胞，显微镜（可以观察细胞中染色体的变异），请设计实验探究此物质的毒性。
因变量：变异细胞的百分比。
自变量：含有毒物质的培养液，正常培养液
（一）、动物细胞全能性实验设计
二、动物体细胞核移植技术
试验一
绵羊去核卵母细胞
绵羊乳腺细胞核
个体
重组细胞
绵羊去核乳腺细胞
绵羊乳腺细胞核
无法到个体
重组细胞
试验二
实验结论：
1、分化动物________有全能性。
2、卵母细胞质能_______________，而乳腺细胞质____。
细胞核
支持胚胎全程发育
不能
动物细胞核移植概念
将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）
分
类
胚胎细胞核移植：
体细胞核移植：
细胞分化程度低，恢复全能性容易
细胞分化程度高，恢复全能性不容易
二、动物体细胞核移植技术
动物细胞核移植类型
资料1：1981瑞士学者伊儿曼斯和霍普将小鼠胚胎的细胞核注入去核的受精卵，获得了胚胎细胞核移植小鼠。
（二）、胚胎细胞核移植和体细胞核移植的比较
二、动物体细胞核移植技术
资料2：1997年韦尔穆特宣布体细胞核移植成功。
供体细胞培养
减数第二次分裂中期（MⅡ期卵母细胞）
去核的卵母细胞
供体细胞注入去核卵母细胞
受体细胞激活，完成减数分裂、发育
胚胎移植
胚胎移植
细胞核移植
1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程
2、保护濒危物种
3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植
4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病
（三）、体细胞核移植技术的应用前景：
（四）、体细胞核移植技术存在的问题：
研究方面：
克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。
克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚
克隆技术效率低
这些问题尚在研究中。
应用上：
生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。
思考：动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？
动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。
要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。
2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体
单克隆抗体
动物细胞融合
知识回顾
(1)
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
植物体细胞过程示意图
去壁
原生质体融合
再生细胞壁
脱分化
再分化
植物体细胞杂交跨越植物种属间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。
可否通过动物的体细胞杂交，来实现优良性状的组合？
猜想
猜想
寻找自然界中的动物细胞融合的例证，以分析我们此猜想有没有可能成功
精卵融合、多核肌肉细胞是融合来的
这是同一物种不同个体的不同细胞之间融合
那不同物种呢？
经过十几亿年的进化，细胞有了识别的功能，它不会让非亲非故的东西进入到自己的领地，它对外来的侵略者始终是要抵抗的，即便进去了，也会把它杀死，这是细胞的一个天性。从限制酶的作用原理就可推断出来。
所以，不管是新的细胞种类还是转化的细胞，很难逃脱细胞的识别并毁灭的功能。
如果侵略者没有被毁灭，则可能会导致整个细胞系统停止运作（罢工）了。由于突然融合进去的东西（细胞质和染色体）会导致它们相互之间的关系很不协调。例如纺锤体对于细胞染色体分离的混乱。
细胞发生融合、存活、增殖的机率是甚微的
然而我们的存在就是将不可能转化为可能，创造奇迹
1970年，人—鼠细胞融合的实验，证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。这是异种动物细胞融合的例子。
一、动物细胞融合技术的发展简史
时光倒流
一、动物细胞融合技术的发展简史
20世纪30年代，在肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中观察到了多核细胞。
20世纪70年代，在蛙的血细胞中也看到了多核细胞。
1962年，日本科学家发现日本血凝性病毒能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。
1965年，英国科学家证实了灭活的病毒在适当条件也可以诱发动物细胞融合。
灭活的病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
仙台病毒：表面有包膜（相当于细胞膜）
糖蛋白
病毒
细胞
糖蛋白折叠病毒与细胞膜靠近
病毒
细胞
膜融合
病毒的融合机制
细胞膜
病毒先融合一个细胞，同样机制融合另外一个细胞。
1.概念：
指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
2.结果：
形成单核的杂交细胞
3.原理：
细胞膜的流动性
4.方法：
二、动物细胞融合
物理法：
电激、振动、离心
化学法：
聚乙二醇（PEG）
生物法：
灭活的病毒
6.意义：
7.应用：
二、动物细胞融合
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。
成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。
特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体
5.过程：
动物细胞A
动物细胞B
诱导，融合
2个完整的杂交细胞AB
有丝分裂
（膜融合、质融合）
（核融合）
注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞
鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、
人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡 、人—胡萝卜等
强调：效应B淋巴细胞是能够产生抗体的B淋巴细胞，课本及后面的学习将其简称为B淋巴细胞
抗体：能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
能产生抗体的细胞是浆细胞（即效应B细胞）。
温故知新
B淋巴细胞
效应B淋巴细胞
记忆B淋巴细胞
分化
三、单克隆抗体
抗体的传统生产方法
抗原
反复注射动物
从动物的血清中分离抗体(浆细胞产生）
该法制备抗体的缺点：
产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。
如何解决这个问题呢？
单克隆抗体！

读下面一段资料，找出单克隆抗体的概念
人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。
1、单克隆抗体的概念
单克隆抗体：单个B细胞（浆细胞）克隆产生的化学性质单一、特异性强的抗体
提示1：对B细胞进行细胞培养可行吗？
提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？
问题：如何大量生产单克隆抗体？请尝试设计一个方案。
2、单克隆抗体的制备
提示3：有什么办法让B淋巴细胞也具有无限增殖的的能力？
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
骨髓瘤细胞能无限增殖
杂交瘤细胞
动物细胞培养技术
设计方案：
动物细胞融合技术
单克隆抗体
猜想：既能产生特异性抗体， 又能大量增殖的细胞
1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验
2、单克隆抗体的制备
①为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？
② 会有几种融合方式？
③ 杂交瘤细胞是如何筛选出来的？有何特点？
④ 是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？
⑤ 专一性抗体和所需抗体的关系是？
⑥如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？
自主看书回答问题：
2、单克隆抗体的制备
BB 、B瘤 、瘤瘤 （B、瘤）
（一选）选择性培养基：只有杂交瘤细胞才能存活
获得产生相应抗体的B细胞（只有一种？）
（二选）：选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞
√
体外培养
小鼠腹腔内培养
杂交瘤细胞特点：既能产生特异性抗体，又能大量增殖。
2、单克隆抗体的制备
单抗制备过程分哪几步？请用箭头把以下代表单克隆抗体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺序是？
你学会了吗？
B 淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
B-B细胞
B-瘤细胞
瘤-瘤细胞
选择培养
杂交瘤细胞（B-瘤细胞）
克隆化培养
抗体检测
产生所需抗体的杂交瘤细胞
体外培养
小鼠腹腔内增殖
单克隆抗体
总结：单克隆抗体的制备概念图
（1）诊断试剂——最广泛应用
准确、高效、简易、快速
单克隆抗体最主要的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
3、单克隆抗体的应用
“生物导弹” ＝单克隆抗体＋药物
单抗导向，药物为弹头
（2）、治疗疾病和运载药物
主要用于治疗癌症治疗，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。
感谢倾听

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