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(共28张PPT)
基因工程 复习
一、DNA重组技术的基本工具
二、基因工程的基本操作程序
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
⑴来源：
⑵作用：
⑶结果：
形成两种末端
1. “分子手术刀” ——限制酶
黏性末端
平末端
识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列(回文序列)，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(用于:切取目的基因和切割运载体)
一、DNA重组技术的基本工具
G A A T T C
G
C T T A A
A A T T C
G
限制酶切割ＤＮＡ分子示意图
C T T A A G
思考：
要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
2个切口， 4个黏性末端
黏性末端
黏性末端
中轴线
什么叫平末端？
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。
练习1.下列关于限制酶的说法正确的是（ ）
A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少
B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
C、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端
D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键
B
练习2.已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有一个酶切位点被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（ ）
A．3 B．4 C．9 D．12
C
2. “分子缝合针” —ＤＮＡ连接酶
⑴作用：连接磷酸二酯键,而不是氢键。
⑵ DNA连接酶的种类
3. “分子运输车” —载体
(2)载体的必要条件（为什么要这些条件？）
有一个至多个限制酶切割位点；
能够在受体细胞中自我复制或整合到染色体 DNA上随染色体DNA进行同步复制;
具有标记基因。
(1)常用的载体：质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒。
⑶真正用作载体的质粒，都要人工改造
四个基本步骤：
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
二、基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
目的基因主要是______________________
编码蛋白质的基因
获取目的基因的常用方法有哪些
⑴从基因文库中获取
⑵利用PCR技术扩增
⑶人工合成
(1)、从基因文库中获取目的基因
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
重组载体
基因组文库
导入受体菌中储存
①基因文库的构建方法
a.基因组文库的构建
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
单链DNA
双链cDNA片段
重组载体
与载体连接
cDNA文库
反（逆）转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
b. cDNA文库的构建-----逆转录法：
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
②.基因文库
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，这样的受体菌群称为基因文库。
种类
基因组文库：含有某种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了某种生物的部分基因，
如：cDNA文库
① 概念：PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：___________、_______________、___________ 、 ___________ .
②原理：__________
多聚酶链式反应
体外
特定DNA片段
DNA双链复制
模板DNA
四种dNTP
引物
热稳定DNA聚合酶
⑵利用PCR扩增目的基因
④过程
a、变性
（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________
b、退火
（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
目的基因
推测
推测
化学合成
化学合成法:
⑶人工合成：
质粒
目的基因
限制酶处理
一个切口
两个黏性末端
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶
表达载体
同一种
⑴构建过程
2.基因表达载体的构建——核心
①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代
②同时使目的基因能表达和发挥作用
⑵基因表达载体的作用(即为什么要构建基因表达载体）
⑶基因表达载体的组成：
它们有什么作用？
①目的基因
②启动子
③终止子
④标记基因
位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合部位，驱动转录
位于基因的尾端,终止转录
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来；
（供重组DNA的鉴定和选择）
练习3.限制性核酸内切酶I的识别序列和切点是一G↓GATCC一，
限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是一↓GATC一。在质粒上有酶I的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。
⑴请画出质粒被限制酶I切割后所形成的黏性末端。
⑵目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
⑶在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接 为什么
可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的
⑴将目的基因导入植物细胞
①农杆菌转化法
②基因枪法
③花粉管通道法
⑵将目的基因导入动物细胞
显微注射技术：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中
3.将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
特点:
能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力
Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上
转化过程:
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
插入
植物细胞染色DNA
表达
新性状
转入
农杆菌
⑶导入微生物细胞
①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少
用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子
②转化方法：
4.目的基因的检测与鉴定
⑴检测
①检测目的基因是否导入
方法:
DNA分子杂交
②表达检测
是否转录—分子杂交
是否翻译—抗原抗体杂交
分子检测法
⑵鉴定
抗虫鉴定
抗病鉴定
活性鉴定等
个体水平的鉴定
练习4.B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中___（单选）。
A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或______中提取总RNA，构建________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
D
精子
cDNA
（3）在过程①、②转化筛选时，过程_____中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程_______在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是___（多选）。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
②
①
BCD

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