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(共44张PPT)
细胞工程和胚胎工程
概念4 细胞工程通过细胞水平上的操作，获得有用的生物体或其产品
4.1植物细胞工程包括组织培养和体细胞杂交等技术
4.2动物细胞工程包括细胞培养、核移植、细胞融合和干细胞的应用等技术
4.3对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体
(1) 植物组织培养：______________________________________________
(2) 植物体细胞杂交：____________________________________________
(3) 动物细胞培养：______________________________________________
(4) 动物体细胞核移植及克隆：__________________________________
(5) 动物细胞融合：______________________________________________
(6) 单克隆抗体的制备：_________________________________________
细胞的全能性。
细胞的全能性、细胞膜的流动性。
细胞增殖。
动物细胞核的全能性。
细胞膜的流动性。
细胞膜的流动性、细胞增殖。
该图可以表示受精作用，
可以表示植物体细胞杂交，
动物细胞融合，
甚至可以表示核移植
细胞工程的原理
1. 植物组织培养
① 培养基的组成：
无机盐、有机物、蔗糖及植物激素、琼脂等。添加蔗糖的目的是
________________________________。
③ 若生产人工种子，则培养到_____________阶段；
若提取细胞产物，则一般培养到__________________阶段；
若培育新个体，则应培养到试管苗阶段。
提供碳源和能源，调节渗透压
胚状体
愈伤组织
② 为了获得脱毒苗，可以选取植物的________进行组织培养。
茎尖
一、植物细胞工程
[常考细节] 培养胡萝卜根组织可获得试管苗，过程如图。
1)步骤③切取的组织块中要带有形成层，原因是
__________________________________________________________________________。
2)步骤⑥要进行照光培养，其作用是
____________________________________________________。
3) 经组织培养得到的植株，一般可保持原品种的______________，这种繁殖方式属于__________繁殖。
诱导叶绿素的形成，使试管苗能够进行光合作用
①　　　　　 ②　　　　　 ③
④　　　　 ⑤　　　　　　 ⑥
形成层形成层细胞的分化程度小，容易脱分化诱导形成愈伤组织
遗传特性
无性
2.植物体细胞杂交技术
一、植物细胞工程
与杂交育种、多倍体育种的区别
染色体丢失
1．某杂种植株的获取过程如图所示，下列有关分析正确的是（ ）
A．叶片经消毒后需用流水多次冲洗，以避免消毒剂长时间作用而产生毒害作用
B．图示①过程采用酶解法获取原生质体时，可用聚乙二醇调节渗透压
C．图示②过程通过抽真空处理使酶溶液渗入细胞间隙，提高酶解效率
D．经④过程获得的杂种细胞经鉴定和筛选后进行植物组培，即可获得目标杂种植株
C
2．甲品种青花菜具有由核基因控制的多种优良性状，但属于胞质雄性不育品种。通过体细胞杂交，成功地将乙品种细胞质中的可育基因引入甲中。相关叙述错误的是（ ）
A．照光处理的甲青花菜下胚轴细胞中有叶绿体，利于筛选杂种细胞B．流程中A处理可使用纤维素酶和果胶酶，B处理可使用聚乙二醇C．杂种细胞经过外源生长素和赤霉素的诱导，直接再分化成为杂种植株D．杂种植株含有控制甲青花菜优良性状的基因，并能通过父本进行传递
C
1.动物细胞培养
二、动物细胞工程
糖类、氨基酸
无机盐、维生素、血清等
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是？
清除代谢产物，同时给细胞提供足够的营养
2. 单克隆抗体的制备
二、动物细胞工程
杂交瘤细胞的特点？
单克隆抗体的优点和应用？
3.细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。人体淋巴细胞尽管有这两条途径，但不能无限增殖，肿瘤细胞尽管没有S途径，但能无限增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖。为了从培养液中分离出杂交瘤细胞，设计获得图④细胞的实验思路：配制动物细胞培养液→加入__________________（填药剂）→接种图_________（填序号）细胞→置于恒温培养箱中培养。
以上设计的原理是杂交瘤细胞可利用____途径合成DNA，从而能在该培养液中增殖。由此分析过程⑤所用的HAT培养基从功能上看属于________培养基。
S
PEG和氨基蝶呤
选择
①③
第二步筛选：无限稀释，克隆化培养和抗体检测阳性
过程④中将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在______________上，尽量使每个孔只接种1个杂交瘤细胞以进行下一步的_____________，然后通过ELISA法（又称酶联免疫吸附试验法）检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，可与___________结合的培养孔为阳性孔。
特定抗原
克隆化培养
多孔培养板
3.动物体细胞核移植技术
二、动物细胞工程
(1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。
③外界环境可能引起不可遗传的变异。
(2)克隆动物的产生是无性繁殖。
4．6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6PD）有F和S两种类型，分别由一对等位基因XF和XS编码。基因型为XFXS的女性体细胞中的两个X染色体，会有一个随机失活，且这个细胞的后代相应的X染色体均会发生同样的变化。将基因型为XFXS的女性皮肤组织用胰蛋白酶处理后先进行细胞的原代培养，再对不同的单细胞分别进行单克隆培养。分别对原代培养和单克隆培养的细胞进行G-6PD蛋白电泳检测，结果如下图所示。有关叙述错误的是（　　）。
A．原代培养的细胞中都含有XF基因和XS基因
B．用胰蛋白酶处理皮肤组织可使其分散成单个细胞
C．原代培养细胞电泳图有2个条带是因为同时检测了多个细胞
D．单克隆培养的细胞1、2、4、5、8、9与3、6、7所含基因不同
D
5．研究人员欲采用“异源囊胚补全法”将人源PS细胞培育出的肾元祖细胞导入囊胚，然后移植到去除生肾区既存的肾元祖细胞的仔猪体内，培育出100%人源iPS细胞来源的肾单位并实际应用于移植医疗（如图所示）。下列说法错误的是（不定项）
A．培育人源肾元祖细胞需向iPS细胞培养液中加入定向诱导分化剂B．过程②需要将荧光蛋白标记的人源肾元祖细胞植入囊胚的内细胞团C．过程③操作之前不需要对代孕仔猪进行超数排卵和同期发情处理D．该技术培育的人源肾脏不必考虑肾移植个体之间的遗传差异
CD
胚胎移植的操作流程
三、胚胎工程
胚胎移植的理论基础？
胚胎移植是基因工程、体外受精、胚胎分割等技术获得转基因哺乳动物个体的最后一个环节！
6.请根据下列两个资料回答相关问题：资料1：用化学方法激活小鼠成熟的卵母细胞得到phESC（孤雌单倍体干细胞），然后通过基因编辑技术使phESC中的3个基因沉默，phESC的细胞核状态便可接近精子细胞核的状态，如图1。资料2：用化学方法激活小鼠的精子得到ahESC（孤雄单倍体干细胞），然后对ahESC中的8个基因进行编辑，ahESC的细胞核便具有卵细胞核的特点，如图2。
(1)体内受精时，在精子触及卵细胞膜的瞬间，__________会迅速产生生理反应阻止后来的精子进入；精子入卵后卵子发生的变化有__________。
透明带
完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体，形成雌原核；卵细胞膜反应
6.请根据下列两个资料回答相关问题：资料1：用化学方法激活小鼠成熟的卵母细胞得到phESC（孤雌单倍体干细胞），然后通过基因编辑技术使phESC中的3个基因沉默，phESC的细胞核状态便可接近精子细胞核的状态，如图1。资料2：用化学方法激活小鼠的精子得到ahESC（孤雄单倍体干细胞），然后对ahESC中的8个基因进行编辑，ahESC的细胞核便具有卵细胞核的特点，如图2。
(2)用促性腺激素对雌性小鼠进行__________处理可得到大量卵母细胞，这些卵母细胞转化为phESC的过程相当于植物组织培养中的__________过程。
(3)ahESC与精子和去核卵母细胞融合后，得到的融合细胞的性染色体组成可能是____________________。
超数排卵
脱分化
XX、XY或YY
6.请根据下列两个资料回答相关问题：资料1：用化学方法激活小鼠成熟的卵母细胞得到phESC（孤雌单倍体干细胞），然后通过基因编辑技术使phESC中的3个基因沉默，phESC的细胞核状态便可接近精子细胞核的状态，如图1。资料2：用化学方法激活小鼠的精子得到ahESC（孤雄单倍体干细胞），然后对ahESC中的8个基因进行编辑，ahESC的细胞核便具有卵细胞核的特点，如图2。
(4)据图分析只依赖雄性小鼠__________（填“能”或“不能”）得到孤雄小鼠，请写出两个理由支持你的判断。理由1：__________________________________；
理由2：__________________________________。
不能
需要将ahESC和另一个精子一起注入到一个去核卵细胞中
重构胚必须移植到雌性小鼠的体内才能发育为个体
A.选择胎猴的体细胞进行核移植的理由是
动物胚胎细胞分化程度高，表现全能性
相对容易
B.卵母细胞在去核环节实际操作中被去除
的不是核膜包被的细胞核，而是纺锤体－染色体复合物
C.使用Kdm4d的mRNA和TSA处理重构胚都不利于重构胚的分裂和发育
D.为得到遗传背景相同的克隆猴用于科研，可用机械方法将早期胚胎随
机切割成2份或4份后再进行胚胎移植
B
7.在体细胞克隆猴培育过程中，为调节相关基因的表达，提高胚胎的发育率和妊娠率，研究人员将组蛋白去甲基化酶Kdm4d的mRNA注入了重构胚，同时用组蛋白脱乙酰酶抑制剂(TSA)处理，具体培育流程如图所示。下列说法正确的是
基因工程
概念5 基因工程赋予生物新的遗传特性
5.1基因工程是一种重组DNA 技术
5.2蛋白质工程是基因工程的延伸
一、基因工程的3种基本工具
（1）根据目的基因确定限制酶
①应选择位于目的基因两端的限制酶；
②不能选择目的基因内部的限制酶；（2）根据质粒的特点确定限制酶
①通常选择与切割目的基因相同的限制酶，确保出现相同的黏性末端；
②在只有一种标记基因时，选择的限制酶不能破坏标记基因。
二、熟记基因工程的四个操作步骤
8．溶菌酶可以催化细菌细胞壁的水解，引起细菌裂解，在临床上可作为消炎药，治疗细菌感染。人溶菌酶是人内源性蛋白质，不会对人体产生不良反应。现利用转基因山羊乳腺生物反应器生产人溶菌酶，回答下列问题：
(1)人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体的构建：对人溶菌酶进行蛋白质测序来推测______序列，从而获得人溶菌酶基因的CDNA．通过这种方法得到的目的基因没有______________________________，必须借助载体，实现其在受体细胞中的扩增和表达。使用____________酶处理人溶菌酶基因和基因表达载体，获得重组DNA分子。
(2)转基因山羊成纤维细胞的制备和鉴定：使用__________仪将重组表达载体注入雌性山羊成纤维细胞。______和核酸分子杂交技术能精准鉴定受体细胞中是否转入人溶菌酶基因，采用后者方法时，需要使用带标记的______作为探针。
mRNA
复制原点、启动子和终止子
限制酶和DNA连接酶
显微操作
PCR
与人溶菌酶基因互补的DNA或RNA（核酸）序列
9．溶菌酶可以催化细菌细胞壁的水解，引起细菌裂解，在临床上可作为消炎药，治疗细菌感染。人溶菌酶是人内源性蛋白质，不会对人体产生不良反应。现利用转基因山羊乳腺生物反应器生产人溶菌酶，回答下列问题：
(3)转基因奶山羊的克隆：对卵母细胞供体注射____________使其超数排卵获得卵母细胞。将饥饿处理后的转基因细胞核移入去核卵母细胞中，电脉冲使其____________。之后胚胎体外培养至__________________阶段再移植到受体羊子宫中，使其妊娠足月分娩。
(4)重组人溶菌酶的获取和抑菌效果检测：收集转基因山羊乳汁，使用离子交换层析实现重组人溶菌酶的_______。为检测重组人溶菌酶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，进行相关实验：用____________法将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液分别接种到________培养基上，并在上面均匀摆放蘸有重组人溶菌酶溶液的无菌滤纸圆片，之后______在37℃恒温培养箱中静置培养。培养后发现，接种有金黄色葡萄球菌的培养基上的滤纸片周围的______更大，说明该种溶菌酶对金黄色葡萄球菌的抑制作用更好。
促性腺激素
细胞融合
囊胚（或桑葚胚）
分离
稀释涂布平板
LB固体
倒置
抑菌圈
10.基因工程载体是DNA重组技术使用的基本工具。回答下列问题：
1)大肠杆菌的质粒常被用来做基因工程中的载体，其主要优点是_______
______________________________________________(至少两项)。基因工程中常使用的载体除质粒外，还有_________________________(至少两项)。
2)在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造过的。在构建基因表达载体时，通过人工改造，基因表达载体中除了含有目的基因外，还必须有________________________等。构建目的基因表达载体的目的一方面是使目的基因在受体细胞中________，并遗传给下一代；另一方面，使目的基因能够________________，从而得到转基因产品或生物。
能自主复制，有标记基因，有一个至多个酶切位点
噬菌体、动植物病毒
启动子、终止子和标记基因
稳定存在
表达并发挥作用
11.（2022湖北节选） 提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系。
3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用_________________酶切割S基因的cDNA和载体。
XbaⅠ、HindⅡ
12.（2021 辽宁）（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入________和________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用________________（填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI G↓GTACC CCATG↑G BamHI G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
EcoRI
PvitⅡ
T4DNA连接酶
13.人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。下图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的部分过程。图中 表示四环素抗性基因， 表示氨苄青霉素抗性基因，4种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题：
（1）为构建重组载体，应选择 酶和 酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为 。
（2）以大肠杆菌为受体细胞，将酶切后的连接产物导入受体细胞。为筛选出导入目的基因的受体菌，首先需要将得到的上述大肠杆菌接种到 的培养基（A）上，一段时间后，将上生长的菌落拓印到含 的培养基（B）上，在上能生长的 （填“是”或“不是”）成功导入重组质粒的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是 。
含氨苄青霉素
四环素
BamHⅠ
BclⅠ
BamHⅠ和BclⅠ酶切形成的粘性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
不是
双抗生素标记法
限制酶
识别序列（箭头表示酶切的位置）
、
14.为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取如下措施：①基因策略：包括提高杀虫基因的表达量、向棉花中转入多种杀虫基因等。例如，早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现在经常将两种或两种以上Bt基同时转入棉花。②田间策略：主要是为棉铃虫提供底护所。例如我国新疆棉区，在转基因棉田周围种植一定面积的非转基因棉花，为棉铃虫提供专门的庇护所：长江、黄河流域棉区多采用将转基因抗虫棉与高粱和玉米等其他棉铃虫寄主作物混作的方式，为棉铃虫提供天然的庇护所。③国家宏观调控政策：如实施分区种植管理等。关于上述基因策略，下列叙述错误的是（ ）
A.提高Bt基因的表达量，可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度
B.转入棉花植株的两种Bt基因的遗传不一定遵循基因的自由组合定律
C.若两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，则两种基因互为等位基因
D.转入多种Bt基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向
C
1.原理与条件
体内复制引物是RNA
引物的基本要求：
引物自身不能环化
两种引物之间不能互补配对
引物长度不宜过短，防止引物随机结合
三、PCR的原理和多项复杂情景
结论：
① n次复制后含有引物A的_______个。
含有引物B的_______个。同时含有引物A和B的_______个。
②从第____次扩增开始能够获得单纯的目的基因。
3
2n-1
2n-1
2n-2
2. PCR过程
三、PCR的原理和多项复杂情景
15.小鼠肿瘤转移抑制基因（ 基因）仅在特定组织中表达。在雌激素诱导下，细胞内信号传导系统可以与 基因启动子的特定区域结合，激活 基因的转录
研究者扩增了 基因启动子不同长度的片段P1、P2、P3和P4，分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因（G）融合的载体，转入体外培养的特定细胞中，在培养液中添加雌激素，以确定不同片段的转录活性。下列叙述不正确的是
A.为了使PCR获得不同长度的DNA片段，需要使用5种引物
B.应选择有 基因但不能表达的小鼠细胞作为转化的受体细胞
C.在细胞中表达出绿色荧光强度高的片段具有较高的转录活性
D.该启动子能响应外源激素信号，可在基因工程中发挥重要作用
B
16.通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变，下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基 不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶 和限制酶 的识别位点。下列有关叙述正确的是( )。
A.限制酶 和限制酶 的识别位点分别加在引物1和引物2的 端
B.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、 等
C.第2轮PCR中，引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占
D
17.某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。
1.若拟突变位点的碱基对为A—T，
则需要让其突变为_______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为__________(假设引物为单链DNA)。
C—G或T—A
G或A
2.中引物2或引物3设计的要求是
将两个基因的未端序列设计在同一引物中（或引物2和引物3中必须具有互补配对的片段）
1. CRISRP/Cas9
CRISPR 相关基因位于细菌中。当外源 DNA 入侵细菌时，细菌将其作为新的“间隔序列”整合到自己的基因组中，从而使 CRISPR 相关基因能“记住"攻击过自己的外源基因。当再次遇到该外源基因时能对其进行识别、定位和剪切，以达到保护自身的目的。其中 crRNA为 CRISPR 相关基因的转录产物，其与 Cas 酶结合就能起到基因剪辑的作用。
拓展
1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________________。
DNA连接酶
例14.[2021海南] CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。
3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是碱基互补配对。随后，Cas9蛋白可切割____________________序列。
Ca2+处理法
目标DNA特定的核苷酸序列
5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。
CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
18.地球上纤维素含量丰富，其酶解产物利用非常广泛，但通常存在纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等问题，导致生产成本较高，影响其在生产生活中的应用。采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造，可有效解决纤维素酶活性低下、催化能力较弱的问题。回答下列问题：
1)蛋白质工程是通过_____________________，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。与基因工程相比，蛋白质工程可以生产__________________。
3)纤维素酶的结合域（CBM）在纤维素的降解中扮演着重要角色，研究发现通过对CBM活性部位的2个色氨酸残基进行改造，会得到能持续催化水解纤维素的纤维素酶，请概述获得该种纤维素酶的大致流程：_________________________________________________________________
基因修饰或基因合成
新的蛋白质
预期新的纤维素酶的功能，设计蛋白质结构，推测在原有序列改造两个色氨酸残基后应有的氨基酸序列，找到到对应的DNA序列人工合成并扩增以得到大量基因片段，导入酵母细胞并使之稳定表达，得到表达产物纤维素酶
4) 纤维素酶连接区的主要作用是柔性连接催化域和结合域，多数由脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸等组成，极易被蛋白水解酶水解，但经糖基化修饰后可以很好地防止蛋白水解酶的水解。推测原因可能是_______________________________________________________________________________。为了深入研究其功能，尽可能地提高纤维素酶的活性，对连接区的改造研究主要体现在__________________________________（答两点）等方面。
5) 对纤维素酶的改造，还可以通过蛋白质定向进化手段实现，为了达到最终的结果，在研究中只需要人为地为蛋白质制造进化条件，就能够使纤维素酶的基因发生改变。与传统的蛋白质工程相比较，该方法具有的优点是__________________________________________（答一点）。
氨基酸序列和蛋白质的空间结构
减少筛选量，减少人工操作步骤
糖基化修饰后酶连接区空间结构发生改变，使色氨酸残基暴露而易被水解的氨基酸被隐藏
(3)融合基因的种类
①由报告基因和功能基因构成的融合基因。常用的报告基因有：GFP（绿色荧光蛋白）基因、GUS基因、LacZ基因和Luciferasese（虫荧光素酶）基因等，主要目的是对功能基因进行示踪，研究其功能及特性。　
②由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合基因。其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白，为生产或科研所用。
③功能基因与功能基因的融合可分为两类：A.相同功能基因的融合，目的是增强基因的功能，扩大基因的应用范围，如杀虫基因之间的融合。B.不同功能基因的融合，为特殊需要而构建，如生产无毒疫苗等。
④报告基因与抗药性基因的融合用于构建融合载体，以利于插入大片段的cDNA或作为双功能标记.
2.融合基因的原理和应用
(1)概念：融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，构成嵌合基因。
(2)表达产物：融合基因的表达产物为融合蛋白
拓展
19.[2023深圳一模] 表面展示技术是通过重组DNA技术，将外源蛋白与细胞表面的蛋白质组装成融合蛋白，从而可展示在细胞表面。回答下列问题。
1) 若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，下图中最适合通过绿色荧光（绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光）确定融合蛋白成功表达的是_____。
注:Ampr为氟卡青霉素抗性基因;→表示转录方向;UAG，UAA，UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。
20.[2018·全国Ⅱ] 某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1- GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：
1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是___________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证_______________________。
甲的完整
甲与载体正确连接
E1和E4
20.B基因存在于水稻基因组中，其在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。
注：Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光
5)个体水平如何筛选出能表达B基因的转基因植株____________________
(1)图中所示的基因表达载体需含有启动子，它是_____识别并结合的位点。
(2)可利用_____细胞中的RNA和PCR技术获取大量的B基因，该过程需要用到_____酶；获得B基因中编码蛋白的序列后，将该序列与Luc基因连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建基因表达载体。
(3)用_____处理农杆菌，使细胞处于一种_____的生理状态，然后将重组的基因表达载体导入其中。
(4)外植体经_____形成的水稻愈伤组织放入农杆菌液浸泡后进行植物组织培养，培养基中需加入_____进行筛选。
加入荧光素后检测该植株卵细胞中是否发出荧光
3.酵母双杂系统的原理
酵母细胞基因转录需要转录因子，转录因子包括DNA结合功能域（DNA-BD）和转录激活结构域（DNA-AD），两结构域分开时不能激活转录。
将待测蛋白质X与DNA-BD融合，蛋白质Y与DNA-AD融合，蛋白质X和Y有相互作用时，两结构域能重新呈现完整转录因子活性，并可激活报告基因的转录。
常见报告基因：①包括荧光素酶基因
②绿色荧光蛋白(GFP) 基因。
③β-半乳糖苷酶基因（LacZ），LacZ表达的酶可以将无色化合物X-gal水解成蓝色产物。
拓展

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