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基因工程
概念图
1.概念:按照人们的意愿，把一种生物的某种 出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里， （定向/不定向）地改造生物的遗传性状。
2.别名: 。
3.原理: 。
4.操作对象: 。
5.操作水平: 。
6.操作环境: 生物 （体内/体外）进行
7.结果： 。
8.优点： （1） 。
（2） 等。
基因重组
DNA分子水平
基因拼接技术或DNA重组技术
基因
体外
创造出符合人们需要的生物类型和生物产品
基因
定向
定向改造生物性状（目的性强）
克服远缘杂交不亲和的障碍
一.基因工程原理
【探究】人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质--胰岛素的理论基础：
（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是 。
（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是 。
（3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为 。
（4）遗传信息的传递都遵循 。
(5) 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
。
DNA
中心法则
基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同
所有生物共用一整套遗传密码
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位
② 遗传信息的传递都遵循中心法则
③ 生物界共同一套遗传密码
一.基因工程原理
工具
工具酶
分子运输车：　　　。
（１）　　　　　　。
（２）　　　　　　 。
限制酶
ＤＮＡ连接酶
运载体
【易错警示】工具酶≠工具
质 粒
λ噬菌体的衍生物
动植物病毒
二.基因操作基本的工具
1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
二.基因操作基本的工具
（1）限制酶切割DNA产生黏性末端的过程和黏性末端的表示方法：
【例析】如EcoRI酶能识别-GAATTC-序列，并在G与A之间切割，请表示:
1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
二.基因操作基本的工具
一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。
（大部分限制酶切割结果为黏性末端）
EcoRⅠ识别的序列
切点
切点
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
Hae Ⅲ识别的序列
（2）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题：
（1）请写出同时用EcoRⅠ切割质粒和含目的基因的DNA的过程。
（2）请写出同时用BamH和 HindⅢ切割质粒和含目的基因的DNA的过程
二.基因操作基本的工具
限制酶切
质粒
二.基因操作基本的工具
DNA连接酶连接
二.基因操作基本的工具
重组质粒
二.基因操作基本的工具
（3）用限制酶切割时需注意的事项
①获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
②获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
二.基因操作基本的工具
③选择限制酶切割位点的基本原则：
A.切割目的基因时： 。
B.切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
二.基因操作基本的工具
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
2.DNA连接酶
二.基因操作基本的工具
（1）限制酶与DNA连接酶的关系(如下图)：
（2）DNA连接酶与DNA聚合酶的关系(如下图)：
相同点——作用位点都在磷酸二酯键
不同点——
DNA聚合酶
DNA连接酶
DNA连接酶
DNA聚合酶：单个核苷酸与DNA片段
DNA连接酶：DNA片段与DNA片段
DNA聚合酶作用需要模板，而DNA连接酶不需要
2.DNA连接酶
二.基因操作基本的工具
　　　项目 种类　　　 作用底物 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
DNA解旋酶
DNA分子
磷酸二酯键
形成黏性末
端或平末端
DNA分子片段
磷酸二酯键
连接DNA分子片段
脱氧核苷酸
磷酸二酯键
形成新DNA分子
DNA分子
磷酸二酯键
形成脱氧核苷酸
DNA分子
碱基对间的氢键
形成单链DNA分子
（3）五种酶的比较
2.DNA连接酶
二.基因操作基本的工具
环状双链DNA分子
噬菌体
有一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
3.载体
二.基因操作基本的工具
能够在宿主细胞中自我复制并稳定保存
对受体细胞无害
λ噬菌体的衍生物
(1)在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
(2)λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是 .病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
物种（组织）特异
例5.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
3.载体
二.基因操作基本的工具
(4)【分子运输车--质粒】
①来源：来源于许多 等生物，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的
（化学本质），故质粒有 个游离的磷酸基团
②氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为 ，还有如：
等；其作用是 。
③复制原点： 。
细菌和酵母菌
双链环状DNA分子
0
标记基因
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
DNA分子复制的起点
卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因
3.载体
二.基因操作基本的工具
(1)质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点）
① 。
② 。
③ 。
(2)质粒 （是/不是）一种细胞器。
(3)细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别
①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。基因工程中的载体可能是物质，如 ；也可是生物，如 ；也可是λ噬菌体的衍生物。
②功能不同：细胞膜上的载体功能是 ;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 。
化学本质和结构相同
能够自我复制
具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等
不是
蛋白质
质粒
动植物病毒
协助细胞膜控制物质进出细胞
目的基因导入受体细胞
总结：易错点拨
3.载体
二.基因操作基本的工具
例6.在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作错误的是( )
A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解
C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同
D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞
E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割
DE
二.基因操作基本的工具
例7.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是(　　)
a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp)
1600；1100；300 800；300
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接
C.a酶与b酶切断的化学键不相同
D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，
D
－TCTAGG－
－AGATCC－
序列会明显增多
二.基因操作基本的工具
科研人员尝试构建IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体
应选择限制酶___________ 来切割质粒A，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时加入DNA连接酶，使得目的基因与质粒A相连。若目的基因与质粒A正向连接，用BamHI和SacI同时切割重组质粒，完全酶切后的产物的长度约为_____________bp。
5480bp、1061
EcoRV
（717bp）
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
获取目的基因的常用方法：
1.从基因文库中获取目的基因
2.人工合成目的基因
基因表达载体的组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因
植物细胞：农杆菌转化法(常用）、基因枪法、花粉管通道法
动物细胞（受精卵）：显微注射法
微生物细胞：感受态细胞法
检测方法：
1.分子水平：DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原－抗体杂交法
2.个体水平：抗虫鉴定 抗病鉴定、活性鉴定等
三.基因工程的基本操作程序
获取目的基因的常用方法：
获取方法
①从基因文库中获得
②利用PCR技术扩增
③人工合成法
A.逆转录法
B.化学合成法
三.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
(2)人工合成法：
逆转录法：即以 作为模板，在 酶的作用下合成 ，若要运用该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的
细胞中提取到胰岛素的mRNA进行逆转录获取胰岛素基因；原因是 。上述方法获得的胰岛素基因（cDNA）在基因结构的特点是 。
mRNA
逆转录
cDNA
胰岛B
胰岛素基因只会在胰岛B细胞中表达，其他细胞中不表达
基因只包括了编码区中的外显子序列，而没有非编码区和内含子序列
三.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
(3)利用PCR技术扩增目的基因
①概念：PCR全称为 ，是一项在生物 （体内/体外）复制特定DNA片段核酸合成技术
②原理： 。
③前提：要有一段 ，以便根据这一序列合成 。
④引物的化学本质：是一小段 ；
⑤两种引物与模板链如何配对？ 。
聚合酶链式反应
体外
DNA双链复制
已知目的基因的核苷酸序列
引物
DNA或RNA单链
引物的5′端与模板链3′端互补配对
【思考】合成引物时是否需要知道目的基因的所有的碱基序列？
三.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
⑥延伸时需要加入两种引物，原因是
。
⑦两种引物的要求：
。
⑧PCR反应的基本步骤： 、 、 。
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
引物自身不能环化
两种引物之间不能互补配对
引物长度不宜过短，防止引物随机结合
变性 复性 延伸
(3)利用PCR技术扩增目的基因
三.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
⑨循环过程
变性
模板DNA加热至900C以上时，模板DNA双链解聚为单链。
复性
温度下降到50℃左右，两种引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
延伸
温度上升到72℃，在Taq酶的作用下，以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则，合成一条新的DNA链
(3)利用PCR技术扩增目的基因
三.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
PCR扩增过程中的循环图示与规律
⑨循环过程
(3)利用PCR技术扩增目的基因
三.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
A.上一次循环的产物为下一循环的模板
B.有最初母链的两个DNA分子只含一个引物，其它子代DNA分子都为两个引物分子
C.处于两引物之间的DNA序列呈指数增长
⑩PCR反应的实验操作
循环数 变性 复性 延伸
预变性 94°C,5min － －
30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
(3)利用PCR技术扩增目的基因
三.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成　　　　　的原料，又可为DNA的合成提供　　。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为　　　　　。细胞内的DNA进行复制时，也需要　　，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加　　　。
DNA子链
能量
RNA单链
引物
Mg2＋
Mg2＋
总结：PCR技术和DNA复制的比较
三.基因工程的基本操作程序
(1)在PCR技术扩增目的基因时 （需要/不需要）解旋酶，原因是
。
(2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计
种引物，进行PCR时需加热至90∽95度然后冷却至55∽60度，此操作的目的是
。
例1.如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题
不需要
PCR过程中是通过高温使DNA双链解聚为单链的，而不是用解旋酶
两
①90∽95度高温使DNA解聚为单链，②然后冷却至55∽60度使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
三.基因工程的基本操作程序
（3）利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两种引物，原因是
　　 ，在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于　　 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。
(4)目的基因能被准确扩增的原因是
。
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
两个引物
从子链的5′端向3′端延伸
5
目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则保证复制准确的进行
(2n+1-2)=62
三.基因工程的基本操作程序
(5)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的__________和_________，前者由________ 自动调控，后者则靠___________来维持。
（6）从理论上讲，在PCR技术中，循环4次产生的DNA分子中，第四次循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
（7）假设DNA片段有150个脱氧核苷酸对，若DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸有70个，则5次循环，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个（不考虑引物所对应的片段）
（8）假设DNA片段有200个脱氧核苷酸对，经3次扩增后，从理论上计算，除需要引物14个外（注：每个引物中含有20个脱氧核苷酸），还需要游离的脱氧核苷酸 个。
温度
PH值
PCR扩增仪
缓冲液
15/16
2480
2520
(2n-1)T
(2n-1)400 - 20×14
(2n+1-2)=14
三.基因工程的基本操作程序
（9）用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如下图所示，X为某限制酶识别序列。扩增得到的绝大部分DNA片段是图A-D中的（ ）
D
三.基因工程的基本操作程序
（1）构建目的：
；
。
（2）构建过程：
2.基因表达载体的构建—基因工程的核心：
同种限制酶
如果使用两种限制酶同时切割目的基因和质粒，有何优点 。
若只考虑两两连接，质粒和目的基因至少可以连接 种；即 。
可防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与运载体的反向连接
3
目的基因-目的基因、质粒-质粒、目的基因-质粒
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用
三.基因工程的基本操作程序
目的基因
载体
限制酶
同种限制酶
DNA连接酶
载体-载体
目的基因-
目的基因
目的基因与运载体结合
载体-目的基因
三.基因工程的基本操作程序
（3）基因表达载体的组成及作用：
①目的基因：能控制表达所需要的特殊性状。
②启动子作用：
。
③终止子：使 终止的特殊结构的DNA片段。
④标记基因：
种类： 。
作用： 。
⑤复制原点： 。
转录
四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因等抗生素抗性基因
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
DNA分子复制的起点
启动子具有物种和组织特异性。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。如：构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是 。
水稻胚乳细胞启动子
是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA
2.基因表达载体的构建—基因工程的核心：
三.基因工程的基本操作程序
目的基因
启动子
终止子
标记基因
复制原点
2.基因表达载体的构建—基因工程的核心：
三.基因工程的基本操作程序
（3）基因表达载体的组成及作用：
A.生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
B.通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
C.目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
D.为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。
理由是：
三.基因工程的基本操作程序
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？
E.如何筛选出插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落？
在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，产生一些菌落，然后将这些菌落按照原来的位置转移到含有四环素的培养基上进行培养，一段时间后，某些菌落将会出现停止增殖的现象，这些菌落的位置在含氨苄青霉素的培养基中对应的位置的菌落即为插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落。（将目的基因插入抗四环素基因内部）
2.基因表达载体的构建—基因工程的核心：
三.基因工程的基本操作程序
（3）基因表达载体的组成及作用：
例2.（2020，高三，衡水）目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于______________________________。观察上图，如果A为质粒，则C表示 。
供重组DNA的鉴定和选择
重组质粒
三.基因工程的基本操作程序
(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
。
三.基因工程的基本操作程序
(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过____________作用恢复________________________键，成功地获得了重组质粒。能形成重组质粒的原因是______________________________________________。
DNA连接酶
磷酸二酯键
两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同
三.基因工程的基本操作程序
(4) 作为受体大肠杆菌应不含________________，以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是
_，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________。
ampR和tetR（或氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因）
能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素
pBR322 质粒
三.基因工程的基本操作程序
(1)转化：指
。
(2)常用的受体细胞：
①原核生物： 。
②真核生物： 。
(3)将目的基因导入受体细胞的原理： 。
(4)常用的方法：
植物细胞： 。
动物细胞： 。
微生物细胞： 。
酵母菌和动植物细胞等
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径
大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌等
农杆菌转化法
显微注射法
感受态细胞法
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
3.将目的基因导入受体细胞：
三.基因工程的基本操作程序
③农杆菌转化法过程:
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
插入
植物细胞染色DNA
表达
新性状
导入
农杆菌
A.农杆菌转化法
3.将目的基因导入受体细胞：
三.基因工程的基本操作程序
提纯含目的基因表达载体
取卵
显微注射
受精卵发育
受精卵
移植到子宫
新性状动物
早期胚胎
B.将目的基因导入动物细胞
3.将目的基因导入受体细胞：
三.基因工程的基本操作程序
C.将目的基因导入微生物细胞
①常用法: .
②常用菌： 。
③微生物作为受体细胞的原因是
。
④过程：
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
Ca2+处理法(感受态细胞法)
大肠杆菌
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
⑤受体细胞用Ca2+处理的目的是
。
⑥用Ca2+处理受体细胞是通过改变 的通透性来完成
使其变为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子
细胞壁
3.将目的基因导入受体细胞：
三.基因工程的基本操作程序
(1)DNA分子探针： 。
(2)检测和鉴定
① ，它是目的基因能否在个体内稳定遗传的关键，采用的技术是 。
② 是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步，该过程采用的技术是 。
③检测目的基因是否成功翻译出蛋白质
A.分子水平检测： 。
放射性同位素标记的含有目的基因的DNA片段
DNA分子杂交技术
分子杂交技术
抗原--抗体杂交
检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否成功转录出mRNA
三.基因工程的基本操作程序
4.目的基因的检测与鉴定：
提取
苏云金杆菌
Bt毒蛋白
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒蛋白的抗体
抗体
蛋白质
出现杂交带
脱分化
组织培养
探针:
32P
转基因生物
的mRNA:
杂交带
三.基因工程的基本操作程序
b.活性比较实验:
将基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同。
B.个体生物学水平的鉴定
a.检测生物是否具有该蛋白质赋予的某种特性以及具有该特性的程度。如：
抗虫：做抗虫接种实验，观察 （害虫/生物）的生存状况
抗病：做病原体接种实验，观察 （病原体/生物）的生存状况
抗盐：将转基因植物移栽到 。
抗寒：将转基因植物移栽到 环境中，观察其生长状况
盐碱地
害虫
生物
低温（寒冷）
三.基因工程的基本操作程序
4.目的基因的检测与鉴定：
【思维探究】
(1)已知真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是
。
(2)人体合成的初始胰岛素，需要经过膜系统加工形成特定的空间结构才有生物活性，把胰岛素基因导入大肠杆菌时形成的胰岛素没有生物活性，原因是
。
(3)为了避免抗虫基因通过花粉传播给其他植物，应将该目的基因导入 （细胞核/细胞质）中理由是
。
基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体，无法对形成的胰岛素进行加工
细胞质
细胞质基因具有母系遗传的特点
三.基因工程的基本操作程序
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，①子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，②若子代全部耐旱。尝试推测该耐旱基因分别整合到了什么位置上？（答“同源染色体的一条上”或“同源染色体两条上”_________________ ， 。
(5)若自交子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为15：1时，则可推测该耐旱基因整合到了什么位置上？（答“同源染色体的一条上”或“两对同源染色体上”）。
_______________________________。
同源染色体的一条上 同源染色体两条上
两对同源染色体上
【思维探究】
三.基因工程的基本操作程序
例5.(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上
游不同长度的片段，将这些片段分别
插入表达载体中进行转化和荧光检测，
以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位
置。相关信息如图所示。
三.基因工程的基本操作程序
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。
SalⅠ
EcoRⅠ
6
三.基因工程的基本操作程序
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________________________。
F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
三.基因工程的基本操作程序
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，
三.基因工程的基本操作程序
据此结果可推测， BCL11A蛋白结合位点位于___________________
___________________________，理由是_______________________
__________________________________________________________
F1～ F4与R扩增产物上均有结合
位点，因此结合位点位于F4所对
应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
引物F4与F5在调控序
根据有无荧光情况判断，
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
列上所对应序列之间的区段上
三.基因工程的基本操作程序

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