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1.2 微生物的培养技术及应用
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学习目标：
概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。
阐明微生物选择培养基的原理。
进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
基础学习
一、微生物的基本培养技术
微生物的类群：病毒、 、真核生物。
1.培养基的配制
（1）培养基概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）培养基作用：用以培养、分离、 、 微生物或积累其 。
（3）培养基类型：
培养基：含凝固剂（如琼脂），用于微生物的分离、计数、鉴定等。
培养基：不含凝固剂，用于微生物的扩大培养、工业生产。
（4）培养基成分： 、 、 、 （大量元素、微量元素）。
组分组分 含量含量 提供的主要营养提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、 和维生素等
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
在主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长的条件有：对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
例如，培养乳酸杆菌需添加 ；培养霉菌需调至 ；
培养细菌需调至中性或 性；培养厌氧微生物需提供 环境。
2.无菌技术
（1）获得纯净的微生物培养物的关键是防止 。
（2）无菌的范围
①实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和 。
②培养的器皿、接种用具和培养基等进行 。
③实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触
注意：为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 上，并在
附近进行。
（3）消毒：使用较为 的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部 微生物。
类型 适用范围 操作方法
日常生活 100℃煮沸5～6min
不耐高温的液体 62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min
生物活体、水源等 擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
接种室、接种箱，超净工作台 紫外线照射30 min
（4）灭菌：指使用 的理化方法杀死物体内外 微生物，包括芽孢和孢子。
类型 适用范围 操作方法
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等 直接在酒精灯火焰的 灼烧
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等 物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
培养基等,生产和实验室常用 高压蒸汽灭菌锅内,100kPa，温度121℃， 15～30min
3.微生物的纯培养
(1)纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
(2)纯培养：获得纯培养物的过程。
具体过程：
(3)酵母菌的纯培养
菌落
定义：单个或少数同种菌体在固体培养基上大量繁殖，形成肉眼可见的子细胞群体。
特征：大小、形状、颜色、光泽度、透明度、隆起程度等。
功能：不同菌落所具有的特征不同，是鉴定 的重要依据。
方法步骤：
①配置培养基：
倒平板注意事项：
ａ．温度：50℃左右（过高：烫手；过低：琼脂会凝固）。
ｂ．操作：在酒精灯火焰附近（防止杂菌污染）。
ｃ．冷凝后平板 （既可以避免培养基中的水分过快蒸发又可防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染）。
②接种和分离酵母菌
接种方法： ， 。
平板划线法注意事项:
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。
②划线首尾不能相接。
③每次划线前接种环进行灼烧灭菌，待冷却后再开始画线。
④划线后，培养皿 培养。
③培养酵母菌
为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上原有微生物。
每次划线前 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到 个细胞。
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
结果分析与评价：
1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
在未接种的培养基表面若没有菌落生长，则说明培养基未被污染且已彻底灭菌，培养基可以使用；
如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功。如果培养基上出现了其他形态的菌落，则说明在纯化过程中，无菌操作还未达到要求，可能所用菌种不纯，或者实验操作操作不规范，被杂菌污染。
二、微生物的选择培养和计数
1.选择培养基
（1）实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
（2）概念：在微生物学中，将 特定种类的微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
（3）类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80℃的高温 水生栖热菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐 金黄色葡萄球菌
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
思考·讨论 选择培养基配方的设计
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
在选择培养基中，以 作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
2.微生物的选择培养
由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行充分 ，然后再将菌液涂布到制备好的 上。
（1）方法：
（2）基本操作：梯度稀释和涂布平板
（3）操作过程
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
②将10g土样加入盛有90mL 的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
取1mL上清液加入盛有 无菌水的试管中，依次等比稀释。
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将 浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将 放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器 后，再进行涂布。
⑥用 将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可 培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 培养。
平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种工具
单菌落的获得 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
用途 纯化菌种，获得单菌落 ① 纯化菌种，获得单菌落②用于
相同点 ①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。
3.稀释涂布平板法—间接计数法
（1）原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的 单菌落，来源于样品稀释液中的 活菌；通过计数平板上的菌落数，就能 出样品中大约含有多少活菌。
（2）计数原则：
①选择菌落数为 的平板计数。
②同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出平均值。
（3）结果分析：
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
②统计结果一般用 数而不是用活菌数来表示。
（4）计算公式：
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M代表稀释倍数
例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) 。
4.显微镜直接计数—直接计数法
（1）方法：利用特定的 或 在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量；
细菌计数板可对细菌等较 的细胞进行观察和计数；
血细胞计数板常用于相对较 的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
（2）优点： 。
（3）缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。
(统计结果比实际结果要 ）
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1.提出问题:如何分离土壤中分解尿素的细菌 每克土壤样品中含有多少分解尿素的细菌
2.培养基
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1000mL
3.实验设计:
(1)土壤取样:先铲去表层土,取距地表 cm的土壤层,将样品装入纸袋中。
(2)样品稀释:一般选用1×104、1×105、1×106倍的稀释液进行平板培养。
(3)微生物的培养与观察：一般在 的温度下培养1～2天，每隔24h统计一次
数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
4.鉴定原理:
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3，使培养基的碱性 ，pH 。在选择培养基中加入 指示剂,培养某种细菌,若指示剂 ,可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
5.操作提示（教材P19）：
（1）将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
（2）要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要 。操作完成后，一定要洗手。
（3）本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
（4）本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
6.结果分析与评价
（1）结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
（2）你是否获得了某一稀释度下菌落数目在30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
（3）你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。
如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。

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