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3.1 重组DNA技术的工具学案
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学习目标：
阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。
认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
进行DNA的粗提取和鉴定。
基础学习
基因工程：
基因工程是指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物 和生物 。从技术操作层面看，由于基因工程是在 水平上进行设计和施工的，因此又叫作 。
(1)操作环境： ；
(2)操作技术： 等技术；
(3)操作结果：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；
(4)操作水平：　　　　　水平；
(4)操作对象：　　　　　；
(5)遗传学原理 。
基因工程诞生的理论基础：
1、不同生物的基因为什么能拼接？
(1)DNA的基本组成单位都是　　　　　　　　　　。
(2)DNA分子都遵循　　　　　　　　　　。
(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的　　　　　 。
2、外源基因为什么能在受体细胞中表达？
(1)基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位。
(2)遗传信息的传递都遵循　　　　　。
(3)生物界共用一套　　　　　。
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
1.概念：切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。
（合成场所： ；合成原料： 。限制酶不是一种酶，而是一类酶）
2．来源：主要从 生物中分离纯化出来的。
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
切割外源DNA使之失效，以保证自身安全。
3.作用特点：识别 DNA分子的特定 序列，并且使每一条链中特定部位的 。
4.作用结果：产生 或 。
（酶切一次，断开 个磷酸二酯键；产生 个黏性末端或平末端。）
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
1.概念：能够将两个 连接起来的酶，称之为DNA连接酶。
2.实质：恢复被限制酶切开的 （作用部位）。
3.DNA连接酶的种类和特点。
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
比较项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 都能催化形成
不 同 点 模板 不需要 需要DNA的 条链作模板
作用 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
作用结果 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链
用途 基因工程 DNA复制
几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
1.作用：将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量 。
2.种类： 、动植物病毒、噬菌体。
3.条件：
(1)具有 ，供外源DNA片段插入其中。
(2)能在受体细胞中进行 ，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
(3)具有 （如四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因），便于重组DNA分子的筛选。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过 的。
思考·讨论 重组DNA分子
1. 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2. 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3. 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
探究·实践 DNA的粗提取与鉴定
1．原理
(1)提取思路
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
(2)提取原理
①DNA不溶于 ，但某些蛋白质溶于 。利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中 不同，它能溶于 的NaCl溶液。
(3)鉴定原理
在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现 色。
2．DNA粗提取的实验过程
(1)称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL ，充分研磨。
(2)在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取 。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取 放入烧杯中。
(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的体积分数为 溶液，静置2～3 min，溶液中出现的 色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃 ，将管底的 (粗提取的DNA)晾干。
3．DNA的鉴定
取两支20 mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
【习题巩固】
1．下列关于限制酶的说法，正确的是(　　)
A．限制酶广泛存在于各种生物中，其化学本质是蛋白质
B．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
C．不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端
D．限制酶均特异性地识别含6个核苷酸的序列
2．下列有关限制性内切核酸酶的叙述中错误的是(　　)
A．用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，4个磷酸二酯键断裂
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越小
C．—CATG↓—和—G↓GATCC－序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同
D．用不同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也可能形成重组质粒
3．下列关于载体的叙述中，错误的是(　　)
A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子
B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点
C．目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒
D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割
4．下列有关质粒的说法正确的是(　　)
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．质粒上碱基之间数量存在A＋G＝U＋C
C．质粒是一种独立于细菌拟核DNA之外的链状DNA分子
D．质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
5．基因工程技术引起的生物变异属于(　　)
A．染色体变异　　　 B．基因突变
C．基因重组 D．不遗传的变异
6．据图分析，下列有关酶的功能的叙述不正确的是(　　)
A．限制酶可以切断a处
B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以切断b处
D．DNA连接酶可以连接c处
7．DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D．DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端

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