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第一讲　基因工程(教材专题1)
一、基因工程的概念
基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
基本过程 剪切——拼接——导入——表达
结果 人类需要的基因产物
二、DNA重组技术的基本工具
1．“分子手术刀”又叫基因剪刀——限制性核酸内切酶
(1)来源：主要从原核生物中分离。
(2)作用特点：特异性，即识别特定的核苷酸序列，切割特定的切点(切割磷酸二酯键)。
(3)结果：产生黏性末端或平末端。
2．“分子缝合针”又叫基因针线——DNA连接酶
(1)种类和本质：E·coli DNA连接酶与T4DNA连接酶，均为蛋白质。
(2)功能上的相同点：均可催化形成磷酸二酯键。
(3)功能不同点：T4DNA连接酶可“缝合”黏性末端和平末端，E·coli_DNA连接酶则只能缝合“黏性末端”，不能缝合平末端。
3．“分子运输车”又叫基因的运输工具——基因进入受体细胞的载体
(1)作用：将外源基因送入受体细胞。
(2)具备的条件：能在宿主细胞内复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点；具有某些标记基因。
(3)种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。
(4)质粒的特点：
①质粒是基因工程中最常用的运载体。
②最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。
③化学本质是小型环状DNA分子。
三、基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取
(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
(2)获取方法：
①从基因文库中获取；
②利用PCR技术扩增目的基因；
③通过DNA合成仪用化学方法直接合成。
2．基因表达载体的构建
(1)基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
(2)基因表达载体的组成：除目的基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因等。
①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
②标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来。
3．将目的基因导入受体细胞
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(2)常用方法：
①植物最常用：农杆菌转化法，其次为基因枪法、花粉管通道法。
②动物：最常用显微注射法，其受体细胞通常为受精卵。
③微生物：感受态细胞法，需用Ca2＋处理细胞。
4．目的基因的检测和鉴定
(1)首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。
(2)其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA。
(3)最后检测目的基因是否翻译出了蛋白质。
(4)有时还需进行个体生物学水平的鉴定。
四、基因工程的应用与蛋白质工程
1．基因工程的应用
技术名称 应用
动物基因工程 提高动物生长速度来提高产品产量；改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体
植物基因工程 培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质
基因治疗 把正常基因导入病人体内，使其表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，分为体内基因治疗和体外基因治疗
2.蛋白质工程
(1)根据蛋白质工程的概念，关注两方面的内容：
①蛋白质工程的基础：基因工程。
②蛋白质工程的目标是：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。
(2)蛋白质工程的手段：对蛋白质的结构进行设计改造，最终必须通过基因来完成。
(3)蛋白质工程的基本途径：
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到或合成相应的脱氧核苷酸序列(基因)。
考点一 DNA重组技术的基本工具(Ⅱ)
考情解读 　　三种基本工具的作用涉及基因工程操作程序的关键步骤，近几年高考考查的频率较高，考查内容包括工具酶类型、实质及作用，运载体作用及特点等，预计今后高考仍可能对各类型操作工具的作用及特点结合图形予以考查。
[做一题]
[例1]　(2012·新课标全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是________________________________________
___________________________________________________________________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
(5)基因工程中除质粒外，________________和________________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是________________________。
[解析]　(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种——黏性末端和平末端。(2)为了保证目的基因与运载体相连，用另一种限制酶切割后形成的黏性末端必须与EcoRⅠ切割形成的黏性末端相同。(3)DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两类。(4)反转录的模板是mRNA，产物是DNA。大量扩增反转录产物常采用PCR技术。(5)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。(6)经Ca2＋处理后处于感受态的大肠杆菌才易吸收周围环境中的DNA分子。
[答案]　(1)黏性末端　平末端　(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同(其他合理答案也可)　(3)大肠杆菌　T4　(4)mRNA(或RNA)　cDNA(或DNA)　PCR　(5)噬菌体　动植物病毒(其他合理答案也可)　(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱(其他合理答案也可)
[链一串]
1．正确界定几种关键酶
种类项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA 分子
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键
作用特点 切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割 将双链DNA分子片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上 将DNA分子两条链之 间的氢键打开
作用结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子
2．限制酶两种作用结果比较
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端(如下图所示)。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
3．基因工程中“分子运输车”——载体的必备条件
(1)对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；
(2)具标记基因，能对重组DNA是否进入受体细胞进行鉴定；
(3)能自我复制，通过复制进行基因扩增；
(4)具有多个酶切位点，供外源基因插入其中，而且每种酶切位点最好只有一个，避免酶切后环状DNA打开，丢失某些片段。
[关键一点]
(1)限制酶与DNA连接酶可存在如下关系：
(2)限制酶不切割自身DNA，原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)DNA连接酶起作用时不需要模板，DNA聚合酶起作用时则需模板。
(4)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端以便连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。
[通一类]
1．科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是(　　)
A．基因自由组合定律
B．半保留复制原则
C．基因分离定律
D．碱基互补配对原则
解析：选D　胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA的黏性末端的碱基必须互补配对才能结合在一起。
2.右图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。
(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是________，二者还具有其他共同点，如①____________，②____________(写出两条即可)。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为__________；可使用________把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________，其作用是____________________________________________________________。
(4)下列常在基因工程中用作载体的是(　　)
A．苏云金芽孢杆菌抗虫基因
B．土壤农杆菌中的RNA分子
C．大肠杆菌的质粒
D．动物细胞的染色体
答案：(1)DNA　能够自我复制　具有遗传效应
(2)DNA连接酶
(3)标记基因　供重组DNA的鉴定和选择
(4)C
考点二 基因工程的基本操作程序
考情解读 　　基因工程的基本操作程序是近几年高考的高频考点，分值比重较大，一般和其他工程结合考查，考查形式既有简答题又有选择题。预计今后高考通过与其他工程技术综合考查学生解决实际问题的能力题目仍会出现。
[做一题]
[例2]　某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程将a转移到马铃薯植物中。经检测，Amy在成熟块茎细胞的细胞间隙中发现。请回答：
(1)在基因工程中，a叫____________，提取它的一个必要步骤是_____________________。它与基因运载工具________结合前还必须经过的处理步骤是__________________________。
(2)Amy在成熟块茎细胞间隙中的发现，说明细菌的基因a已整合到上图中的[　]________或[　]________结构中。
(3)合成Amy的过程分为转录和翻译两大步骤，Amy合成并分泌到细胞外，定位在细胞间隙中，参与该过程的细胞器有[　　　　]________________________________________。
(4)Amy的基本组成单位是__________，各组成单位间靠________相连。
(5)以本图比作马铃薯块茎的成熟细胞时该图多画了[　]__________________________。
[解析]　本题主要是把基因工程与细胞的一些基础知识相结合在一起了，巩固了目的基因的提取，基因运载工具，转录与翻译，细胞的结构与功能等基础知识。(1)耐高温淀粉酶(Amy)基因a为目的基因，提取目的基因时要用限制酶切割，并用同种限制酶切割运载体。(2)细菌的基因能整合到此图的细胞核DNA 上和线粒体的DNA上。(3)耐高温淀粉酶(Amy)为分泌蛋白，其形成过程依次经过了核糖体，内质网，高尔基体，此过程需要线粒体提供能量。(4)此酶的本质是蛋白质，基本组成单位是氨基酸，氨基酸脱水缩合形成肽键。(5)马铃薯块茎不能进行光合作用，所以不存在叶绿体。
[答案]　(1)目的基因　用限制酶切出黏性末端　运载体　用限制酶使质粒露出黏性末端
(2)⑤　细胞核　⑧　线粒体
(3)⑦⑥④⑧　核糖体、内质网、高尔基体、线粒体
(4)氨基酸　肽键
(5)③　 叶绿体
[链一串]
1．目的基因的获取
(1)直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。
(2)人工合成目的基因的常用方法：
①已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
②以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。
(3)利用PCR技术扩增目的基因：
①原理：DNA双链复制。
②条件：模板、四种游离的脱氧核苷酸；热稳定的DNA聚合酶、引物等。
③过程：加热至90～95℃，DNA解链→冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链→加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
2．基因表达载体的构建
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)
(3)构建步骤：
3．将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合吸收DNA感受态细胞分子
4.目的基因的检测和鉴定
类型 步骤 检测内容 方法 结果
分子检测 第一步 目的基因是否进入受体细胞 DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间) 是否成功显示出杂交带
第二步 目的基因是否转录出信使RNA 分子杂交技术(DNA和RNA之间)
第三步 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原－抗体杂交方法
个体水平检测 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等
[通一类]
3．下列有关基因工程操作的叙述正确的是(　　)
A．用同种限制性核酸内切酶切割运载体与目的基因可获得相同的黏性末端(平末端)
B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同
C．检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功
D．用含抗生素抗性基因的质粒作为运载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接
解析：选A　一种氨基酸可对应多个密码子，以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列可能不同。只有目的基因在受体细胞中成功表达才标志着基因工程操作的成功。用含抗生素抗性基因的质粒作为运载体，是因为抗性基因作为标记基因可检测载体是否导入到受体细胞中。
4．(2012·海南高考)已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产，乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。因此，可将丙种蛋白质基因转入到甲种农作物体内，使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。
回答下列问题：
(1)为了获得丙种蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出丙种蛋白质的________序列，据此可利用________方法合成目的基因。获得丙中蛋白质的基因还可用________、________方法。
(2)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需使用________酶和________酶。
(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗________的危害。
(4)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子________(填“含有”或“不含”)丙种蛋白质基因。
解析：(1)在已知蛋白质的氨基酸序列的情况下，可根据氨基酸和碱基的对应关系，推出合成该蛋白质的基因序列，然后用DNA合成仪通过化学方法来合成目的基因。此外也可以从基因文库和通过PCR方法获取目的基因。(2)构建重组质粒时，需要用限制酶将运载体切开，并用DNA连接酶将目的基因连接到运载体上，从而构建基因表达载体。(3)愈伤组织中含有丙蛋白，说明丙蛋白的基因得到了表达，在培养成的植株体内也含有丙蛋白，乙昆虫食用丙蛋白后会死亡，则该植株可抵抗乙昆虫的危害。(4)用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，仅仅在该叶片内部分细胞中能合成丙蛋白，而该植株的种子和其他的营养器官均不含有重组质粒，也就不含有丙种蛋白质的基因。
答案：(1)基因　化学　基因文库　PCR(其他合理答案也可)　(2)限制　DNA连接　(3)乙种昆虫　(4)不含
考点三 基因工程的原理(Ⅱ)、基因工程的应用、蛋白质工程的原理及应用(Ⅰ)
考情解读 　　近几年高考以基因工程和蛋白质工程的成果作为背景，以大量的基因工程或蛋白质工程案例作为载体，考查基因工程和蛋白质工程的基本原理和应用。考查形式以简答题为主，预计今后高考中可结合当今社会热点(如转基因食品，基因治疗等)或科技前沿等载体命制基因工程或蛋白质工程的应用类题目。
[做一题]
[例3]　(2013·福建高考)克隆猪成功率较低，与早期胚胎细胞的异常凋亡有关。Bcl 2基因是细胞凋亡抑制基因，用PCR技术可以检测该基因转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。克隆猪的培育及该基因转录水平检测流程如图。
请回答：
(1)图中重组细胞的细胞核来自________细胞，早期胚胎移入受体子宫后继续发育，经桑椹胚、囊胚和______胚最终发育为克隆猪。
(2)在PCR过程中可检测出cDNA中Bcl 2 cDNA的分子数，进而计算总mRNA中Bcl 2 mRNA的分子数，从而反映出Bcl 2基因的转录水平。
①图中X表示________过程。
②从基因组数据库中查询Bcl 2 mRNA的核苷酸序列，以便根据这一序列设计合成________用于PCR扩增，PCR过程第一轮循环的模板是________。
[解析]　本题考查基因工程、细胞工程和胚胎工程的相关知识，意在考查理解能力和分析能力。(1)核移植技术是将供体细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞中，形成重组细胞的过程。结合图形可知，图中重组细胞的细胞核来自良种猪的体细胞；早期胚胎经桑椹胚、囊胚和原肠胚，最终发育为个体。(2)①图中X过程是mRNA反转录形成cDNA的过程。②利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，用于PCR扩增，PCR过程第一轮循环的模板是目的基因，即Bcl 2cDNA。
[答案]　(1)体　原肠
(2)①反转录　②引物　Bcl 2 cDNA
[链一串]
(1)乳腺生物反应器：是指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。受生物性别的限制，若从动物尿液中提取目的基因产物则不受性别限制。
(2)基因治疗：是把正常的基因导入受体细胞中，以表达正常产物，从而治疗疾病，对原有细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变，是治疗人类遗传病的根本方法，但由于尚未全面了解基因调控机制和疾病产生的分子机理，基因治疗目前只是处于初期的临床试验阶段。
(3)基因工程的目的不同，可选用的受体细胞不同。若生产基因工程药品，受体细胞一般选用微生物，利用微生物繁殖速度快的特点，可在短期内获得大量产品。
(4)蛋白质工程与基因工程的比较：
　　项目区别与联系　　 蛋白质工程 基因工程
原理 中心法则的逆推 人工DNA(基因)重组
区别 过程 预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因) 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造、生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程；蛋白质工程离不开基因工程，而基因工程中所利用的某些酶也需要通过蛋白质工程进行修饰或改造，以提高其功能，因此两者是相互促进的
[通一类]
5．培育作为“生物反应器”的动物可以生产许多珍贵的医用蛋白，该动物的培育过程涉及的现代生物技术有(　　)
①基因工程　②体外受精　③胚胎移植　④动物细胞培养
A．①②③　　　　　　　　 B．②③④
C．①③④ D．①②③④
解析：选D　生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，用于表达的生物反应器包括动物血液、乳腺等。作为生物反应器的动物的培育过程是将目的基因导入受精卵中，将其培育到桑椹胚或囊胚阶段，再将其移入代孕动物的子宫中，使其生长发育成转基因动物，这样就能够实现动物蛋白的工业化生产。
6．下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答下列问题：
(1)代表蛋白质工程操作思路的过程是________；代表中心法则内容的是________。(填写数字)
(2)写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容：
①__________；②__________；③__________；④__________；⑤__________。
(3)蛋白质工程的目的是__________，通过__________来实现。
(4)从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是________的。
解析：蛋白质工程是从预期蛋白质功能开始，中心法则是从基因转录、翻译开始；蛋白质工程的目的是对蛋白质的结构进行分子设计，它是通过基因合成或基因修饰实现的，蛋白质工程的基本途径与中心法则相反。
答案：(1)④⑤　①②③　　(2)转录　翻译　折叠　分子设计　合成DNA　(3)对蛋白质的结构进行分子设计　基因合成或基因修饰　(4)相反
一、选择题
1．(2013·江苏高考)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(多选)(　　)
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
解析：选BD　设计引物时应当考虑由此扩增的目的基因与载体两端的序列进行互补配对；PCR体系中应用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶。
2．限制酶MunⅠ和限制酶EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。下图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因运载体的质粒是 (　　)
解析：选A　由图可知，质粒B上无标记基因，不适合作为运载体；质粒C和D的标记基因上都有限制性内切酶的识别位点。质粒A有标记基因且MunⅠ的切点不在标记基因上。
3．下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是(　　)
A．cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，基因组文库中含有某种生物的全部基因
B．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同
C．cDNA文库中的基因都没有启动子
D．一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种
解析：选B　cDNA文库中的DNA来源于mRNA的反转录过程，所以该DNA(或基因)与该生物体内的原DNA在结构上是有区别的，如不含有启动子、内含子等。
4．基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据图判断下列操作正确的是(　　)
A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
解析：选D　因为目的基因要切下而质粒只要切开，酶Ⅱ识别序列和切点是—↓GATC，单独使用时可以把目的基因和质粒都切断，限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，只能把它们切开，单独使用时不能切下，所以切目的基因用限制酶Ⅱ切割，质粒用限制酶Ⅰ切割；因为用限制酶Ⅰ切割质粒时破坏了GeneⅡ，所以只能用GeneⅠ作为标记基因。
5．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是(　　)
A．人工合成目的基因
B．目的基因与运载体结合
C．将目的基因导入受体细胞
D．目的基因的检测和表达
解析：选C　人工合成目的基因过程需要碱基互补配对过程；目的基因与运载体结合涉及黏性末端的互补配对；目的基因的检测和表达涉及了DNA的杂交过程，要进行转录和翻译，因此它涉及碱基互补配对的过程。
6．下列关于蛋白质工程的说法，错误的是(　　)
A．蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类需要
B．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构
C．蛋白质工程能产生自然界中不曾存在的新型蛋白质分子
D．蛋白质工程与基因工程密不可分，又称为第二代基因工程
解析：选B　由于基因的结构决定蛋白质的结构，因此，要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造基因来完成，而不是直接对蛋白质分子进行操作。
二、非选择题
7．豇豆对多种害虫具有抗虫能力，根本原因是豇豆体内具有胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI基因)。科学家将其转移到水稻体内后，却发现效果不理想，主要原因是CpTI蛋白质的积累量不足。经过在体外对CpTI基因进行了修饰后，CpTI蛋白质在水稻中的积累量就得到了提高。修饰和表达过程下图所示：
请根据以上材料，回答下列问题：
(1)CpTI基因是基因工程中的______________，为减少工作量和盲目性，获取CpTI基因时应尽可能采用人工合成基因的方法，目前主要有两条途径：一是利用mRNA为模板合成所需基因，完成这一过程需要________酶和DNA聚合酶等；二是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出目的基因结构中的核苷酸序列，再通过化学方法合成目的基因。
(2)“信号肽”序列及“内质网滞留信号”序列之所以能修饰到CpTI上，是由于其基本组成单位是________________，在①过程中，要使用______________酶，②过程称为________。
(3)检测修饰后的CpTI基因是否表达的最好方法是____________________。
解析：由mRNA为模板合成所需基因的过程为逆转录的过程，需要逆转录酶；基因的组成单位是(四种)脱氧核苷酸，重组DNA的过程中要用到DNA 连接酶，②过程是以DNA为模板形成RNA的转录过程。
答案：(1)目的基因　逆转录
(2)(四种)脱氧核苷酸　 DNA连接　 转录
(3)让多种害虫食用水稻叶片，然后观察害虫是否死亡
8．下图是从酵母菌中获取某植物需要的控制某种酶合成的基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：
(1)图中cDNA文库________基因组文库(填“大于”、“等于”或者“小于”)。
(2)①过程提取的DNA需要________的切割，B过程是________。
(3)为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法，其原理是________。
(4)目的基因获取之后，需要进行________，其组成必须有________以及标记基因等，此步骤是基因工程的核心。
(5)将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是________，其能否在此植物体内稳定遗传的关键是____________，可以用________技术进行检测。
(6)如果要想使该酶活性更强或具有更强的耐受性，需要对现有蛋白质进行改造，这要通过蛋白质工程。首先要设计预期的________，再推测应有的氨基酸序列，找到相对应的________。
(7)除植物基因工程硕果累累之外，在动物基因工程、基因工程药物和基因治疗等方面也取得了显著成果，请列举出至少两方面的应用：______________________________________。
解析：cDNA文库为部分基因，它小于代表该物种全部基因的基因组文库；获取目的基因的方法包括直接分离法、人工合成法及用PCR技术直接扩增目的基因等。目的基因导入双子叶植物常用的方法为农杆菌感染法，目的基因导入后可用DNA分子杂交法进行检测。
答案：(1)小于　(2)限制酶　逆转录　(3)PCR技术　DNA复制　(4)基因表达载体的构建　启动子、终止子、目的基因(复制原点可不答)　(5)农杆菌转化法　目的基因是否整合到植物细胞的染色体上　DNA分子杂交　(6)蛋白质结构　脱氧核苷酸序列　(7)乳腺生物反应器；体外基因治疗复合型免疫缺陷综合症(其他合理答案也可)
9．土壤农杆菌是一种细菌，在转基因植物研究上有很重要的应用。下图是某植物转基因技术流程示意图：
(1)形成重组DNA的过程需要的酶有________和________。
(2)所谓农杆菌转化是指让其侵染植物组织细胞从而把目的基因导入植物细胞，在这个过程中________(是/不是)所有细胞都导入了目的基因。
(3)培养基中除含有必要的营养物质、琼脂和激素(如：________和________)外，还必须加入________。
解析：在基因工程中必须先用同一种限制酶分别处理目的基因和运载体以获得相同的黏性末端，再加入DNA连接酶获得重组DNA；农杆菌侵入植物组织过程中，并不是所有的农杆菌都能进入，所以并不是所有的受体细胞都导入了目的基因；卡那霉素抗性基因是标记基因，培养基中加入卡那霉素以便进行筛选。
答案：(1)限制酶　DNA连接酶　(2)不是　(3)生长素　细胞分裂素　卡那霉素
10．(2014·福州质检)人外周血单核细胞能合成白介素2(IL－2)。该蛋白可增强机体免疫功能，但在体内易被降解。研究人员将IL－2基因与人血清白蛋白(HSA)基因拼接成一个融合基因，并在酵母菌中表达，获得具有IL－2生理功能、且不易降解的IL－2－HSA融合蛋白。其技术流程如图。请回答：
(1)培养人外周血单核细胞的适宜温度为________℃；图中②表示________过程。
(2)表达载体1中的位点________，应为限制酶BglⅡ的识别位点，才能成功构建表达载体2。
(3)表达载体2导入酵母菌后，融合基因转录出的mRNA中，与IL－2蛋白对应的碱基序列不能含有________(起始、终止)密码子，才能成功表达出IL－2－HSA融合蛋白。
(4)应用________杂交技术可检测酵母菌是否表达出IL－2－HSA融合蛋白。
解析：(1)人体的体温是37℃左右，因此培养人体细胞的最适宜温度就是37℃。由mRNA到cDNA过程是逆转录过程。(2)根据图解可知目的基因的两端分别是由限制酶EcoR Ⅰ、Bgl Ⅱ切割的，一般用同一限制酶切割才能形成相同的黏性末端，表达载体1中的位点a具有EcoR Ⅰ的识别位点，因此位点a应为限制酶Bgl Ⅱ的识别位点，才能成功构建表达载体2。(3)mRNA中如果含有终止密码子，则会导致翻译终止，不能合成出目的蛋白。(4)抗原、抗体的结合具有特异性，抗原—抗体杂交技术可以迅速检测出酵母菌是否表达出IL－2－HSA融合蛋白。
答案：(1)37(或36.5±0.5)　反(或逆)转录
(2)a (3)终止 (4)抗原—抗体
11．(2013·北京高考)斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。具有纯合突变基因(dd)的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。利用转基因技术将绿色荧光蛋白(G)基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。未整合G基因的染色体的对应位点表示为g。用个体M和N进行如下杂交实验。
(1)在上述转基因实验中，将G基因与质粒重组，需要的两类酶是________和________。将重组质粒显微注射到斑马鱼________中，整合到染色体上的G基因______后，使胚胎发出绿色荧光。
(2)根据上述杂交实验推测：
①亲代M的基因型是________(选填选项前的符号)。
a．DDgg　　　　　　　　　　 b．Ddgg
②子代中只发出绿色荧光的胚胎基因型包括________(选填选项前的符号)。
a. DDGG b. DDGg
c. DdGG d. DdGg
(3)杂交后，出现红·绿荧光(既有红色又有绿色荧光)胚胎的原因是亲代________(填“M”或“N”)的初级精(卵)母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的________发生了交换，导致染色体上的基因重组。通过记录子代中红·绿荧光胚胎数量与胚胎总数，可计算得到该亲本产生的重组配子占其全部配子的比例，算式为________________________________。
解析：(1)重组质粒的构建需要两种工具酶：限制性核酸内切酶和DNA连接酶。动物细胞工程的受体细胞一般是受精卵，因为动物受精卵全能性较高。斑马鱼胚胎发出绿色荧光是由于G基因表达产生了绿色荧光蛋白。(2)由于M胚胎期无荧光，则基因型为D _ gg，后代出现了绿色荧光(D_ G _)和红色荧光(ddgg)的子代胚胎，可推出M的基因型是Ddgg。N的基因型是DdGg，M和N交配，子代中只发出绿色荧光的胚胎基因型为DDGg或DdGg。(3)正常情况下M、N交配不会产生红·绿荧光子代胚胎，但若亲代N在减数分裂过程中同源染色体的非姐妹染色单体间发生了交叉互换(如图所示)，则子代中会出现ddGg的红·绿荧光胚胎。
若亲代N产生的配子中重组的配子(dG和Dg)占的比例为x，则dG占的比例为x/2，又因亲代M产生两种比例相等的配子Dg、dg，可知子代胚胎中红·绿荧光胚胎的概率为x/4，即x/4＝(红·绿荧光胚胎数/胚胎总数)，可推出重组配子占其全部配子的比例为4×(红·绿荧光胚胎数/胚胎总数)。
答案：(1)限制性核酸内切酶　DNA连接酶　受精卵　表达　(2)①b　②b、d　(3)N　非姐妹染色单体　4×(红·绿荧光胚胎数/胚胎总数)
第二讲　细胞工程(教材专题2)
一、细胞工程
1．概念
是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过某种工程学手段，在细胞水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质，从而获得新型生物或特种细胞产品、或产物的一门综合性科学技术。
2．对概念的理解
(1)应用的原理和方法：细胞生物学和分子生物学。
(2)研究的水平：细胞整体水平或细胞器水平。
(3)研究的目的：按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。
二、植物细胞工程
1．植物组织培养技术的原理、条件及过程
(1)原理：植物细胞具有全能性。
(2)全能性表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。
(3)过程：
2．植物体细胞杂交
(1)概念：用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。
(2)原理：细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。
(3)流程：
4．植物细胞工程的应用
(1)植物繁殖新途径：微型繁殖、作物脱毒、人工种子等。
(2)培养作物新品种：单倍体育种和突变体的利用。
(3)细胞产物的工厂化生产：利用植物组织培养技术生产蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料和生物碱等。
二、动物细胞工程
1．动物细胞工程常用的技术手段
常用手段：动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
2．动物细胞培养的过程
3．动物体细胞克隆
(1)过程：动物体细胞克隆包括动物细胞核移植和胚胎移植两个过程。
(2)核移植的原理是动物细胞核具有全能性。
(3)核移植分类：胚胎细胞核移植和体细胞核移植。
(4)核移植过程：
(5)选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作，卵(母)细胞细胞质多，营养丰富，含有促进核全能性表达的物质。
(6)体细胞核移植技术存在的问题是什么？
克隆动物存在着健康问题，表现出遗传和生理缺陷等。
4．动物细胞融合及单克隆抗体制备
(1)原理：细胞膜的流动性。
(2)方法：物理法(离心、振动、电激)、化学法和生物法(灭活病毒)。
(3)应用：单克隆抗体，过程如下：
(4)单克隆抗体的特点：特异性强、灵敏度高、并可大量制备。
考点一 植物的组织培养与植物体细胞杂交(Ⅱ)
考情解读 　　植物的组织培养与植物体细胞杂交在农业生产中的应用极为广泛，成为新课标高考的热点，近几年在高考试题中的比重逐渐提升。考查形式以简答题为主，常与植物育种等知识结合以图解的形式呈现，以考查基本概念和获取信息的能力为主。
[做一题]
[例1]　(2013·新课标卷Ⅱ)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。回答下列问题：
(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的________，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成________组织，然后经过________形成完整的杂种植株。这种培育技术称为_______________________________________________________________________________。
(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指______________________________________。假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是_____________________________________________________________________________。
(3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖，经植物组织培养得到的________等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。
[解析]　本题主要考查了植物体细胞杂交技术，意在考查识记能力和理解能力。要培育同时含有A和B的新型药用植物，可采用植物体细胞杂交技术。(1)植物体细胞杂交技术的第一步是用纤维素酶和果胶酶去除两种植物细胞的细胞壁，获得具有活力的原生质体。诱导融合成功后获得的杂种细胞，经脱分化培养成愈伤组织，然后经过再分化形成完整的杂种植株。(2)多倍体的概念：体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体。由于甲与乙有性杂交的后代中分别含有甲植物和乙植物的一个染色体组，两个染色体组中的染色体互不相同，杂交后代细胞中无同源染色体，减数分裂过程中会发生联会异常，不能产生正常的生殖细胞，故该植株不可育。而体细胞杂交获得的杂种植物分别含有甲植物和乙植物的两个染色体组，含有同源染色体，减数分裂过程中联会正常，能产生正常的生殖细胞，故该杂种植株可育。(3)制备人工种子的材料可以是经组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等。
[答案]　(1)纤维素　果胶　原生质体　愈伤　再分化(或分化)　植物体细胞杂交技术　(2)体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体　在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常　(3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽
[链一串]
1．植物细胞工程的基本技术
(1)植物组织培养技术：
①原理：植物细胞的全能性，即具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整个体的潜能。
②过程：
高度分化的组织形成愈伤组织幼根和芽完整植株
(2)植物体细胞杂交技术：
①概念：将不同植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，培育成新的植物体的技术。
②原理：细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。
③过程如下图所示：
④人工诱导的方法：
a．物理法：离心、振动、电刺激等。
b．化学法：一般用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂诱导原生质体融合。
c．融合成功的标志：杂种细胞再生出细胞壁。
⑤意义：克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍。
2．植物细胞工程的应用
(1)植物繁殖的新途径：
①微型繁殖：
a．概念：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养法
b．特点
②作物脱毒：选取作物无毒组织(如茎尖)进行组织培养，获得脱毒苗。
③人工种子：以植物组织培养得到的胚状体等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。
(2)培育作物新品种：用植物的花药进行离体培养形成单倍体，再经人工诱导染色体加倍后筛选出需要的新品种；利用组织培养过程中出现的突变体，培育新的品种。
(3)细胞产物的工厂化生产：用人工培养的愈伤组织提取细胞中的某种成分。
[关键一点]　　细胞分裂素与生长素对细胞分化的影响
使用顺序 结果 生长素/细胞分裂素比值 结果
先生长素，后细胞分裂素 有利于分裂但不分化 比值高 促根分化，抑芽形成
先细胞分裂素，后生长素 细胞既分裂也分化 比值低 促芽分化，抑根形成
同时使用 分化频率提高 比值适中 促进愈伤组织生长
[通一类]
1．(2012·广东高考)培育草莓脱毒苗所采用的主要技术是(　　)
A．组织培养　　　　　　　 B．细胞杂交
C．显微注射 D．核移植
解析：选A　植物分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，将植物茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗；植物体细胞杂交可以克服远缘杂交不亲和的障碍，获得具有两个亲本优良性状的植株；显微注射是将带有目的基因的质粒导入动物受体细胞中的技术；核移植是动物细胞工程中经常用到的生物技术。
2．“白菜—甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长周期短、耐热性强和易于储存等优点。下图是“白菜—甘蓝”的杂交过程示意图，请据图回答：
(1)在上述方法中，除去细胞壁的方法是________。
(2)图中原生质体A和原生质体B能融合形成一个杂种细胞，所依据的生物学原理是___。
(3)通常情况下，白菜和甘蓝杂交是不能成功的，原因是________________________。
(4)通过细胞工程获得的“白菜一甘蓝”是否可育？为什么？
________________________________________________________________________。
解析：(1)植物体细胞杂交时先要除去细胞壁得到原生质体。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，因而用纤维素酶和果胶酶除去细胞壁较为合适。(2)原生质体融合时首先是细胞膜的融合，这说明了细胞膜具有流动性。(3)自然状态下，白菜和甘蓝为不同物种，存在着生殖隔离，所以不能杂交。(4)通过体细胞杂交获得的“白菜—甘蓝”是可育的，因为它的细胞中存在同源染色体，可以通过减数分裂产生有性生殖细胞，再经受精作用形成种子。
答案：(1)酶解法(用纤维素酶、果胶酶除去细胞壁)
(2)细胞膜的流动性　(3)存在生殖隔离
(4)可育。经减数分裂可产生有性生殖细胞，再经受精作用可形成受精卵并发育成种子
考点二 动物细胞培养与核移植技术(Ⅰ)
考情解读 　　对本考点的考查主要以简答题的形式呈现。常与一些社会热点和科技前沿知识相联系，以相关的重要成果为背景进行命题，考查应用基本原理分析解决实际问题的能力。预计在今后的高考中，与基因工程、胚胎工程相结合的试题仍会出现。
[做一题]
[例2]　克隆羊的成功轰动世界，它不仅奠定了克隆性治疗疾病的基础，又解决了器官移植中供体不足的问题，同时也给人类带来了一些过去尚未遇到的问题。下图为人类对克隆羊技术的拓展和应用，请据图回答下列问题：
(1)图中所涉及的现代生物技术有________和________等。
(2)下列有关胚胎移植的叙述正确的有________(多选)。
A．冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子
B．只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受
C．供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应
D．不同动物胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在原肠胚时期进行
(3)图中两个克隆动物长大后，各方面特征与原型动物相同，这说明________具有全能性。
(4)使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入________等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的适宜________。
(5)图中从内细胞团到胚胎干细胞的培养过程中，一般用________处理内细胞团，使之分散成单个细胞。
[解析]　经核移植形成的重组细胞培育成的新个体其性状与供核方原型动物相同，表明细胞核具全能性；进行动物细胞培养时，培养基中常需添加动物血清，且需保证细胞生活所需要的适宜温度和pH。欲使动物细胞分散成单个细胞，常用胰蛋白酶处理。
[答案]　(1)核移植　胚胎移植　细胞培养(任意两个)　(2)AB　(3)动物体细胞核　(4)血清　温度和pH
(5)胰蛋白酶
[链一串]
1．动物细胞培养和动物体细胞核移植的比较
项目 动物细胞培养 动物体细胞核移植
原理 细胞增殖 动物细胞核的全能性
过程
结果 获得细胞群 获得与供体遗传物质基本相同的个体
联系 动物细胞培养是体细胞克隆的基础
[关键一点]
(1)动物细胞培养中两次用到胰蛋白酶，第一次用胰蛋白酶处理剪碎的组织使之分散成单个细胞，第二次使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来。
(2)核移植产生的克隆动物与提供细胞核的亲本不同的原因：
①克隆动物细胞质基因来源于另一个亲本，所以与植物组织培养不同(只来自于一个亲本)，即克隆动物遗传物质来自两个亲本。
②在发育过程中可能发生基因突变、染色体变异导致性状改变。
③外界环境条件的影响引起不可遗传的变异。
2．动物细胞培养需要满足的条件
(1)无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
(2)营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。
(3)温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃±0.5℃；pH：7.2～7.4。
(4)气体环境：95%空气＋5%CO2，其中O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
[通一类]
3．(2013·大纲卷)关于动物细胞培养和植物组织培养的叙述，错误的是(　　)
A．动物细胞培养和植物组织培养所用培养基不同
B．动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶
C．烟草叶片离体培养能产生新个体，小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖
D．动物细胞培养可用于检测有毒物质，茎尖培养可用于植物脱除病毒
解析：选B　动物细胞培养用液体培养基，而植物组织培养用固体培养基；动物细胞培养过程中要加入胰蛋白酶，而植物组织培养过程中则不用；植物细胞具有全能性，所以烟草叶片离体培养能形成新个体，而动物细胞离体培养只能增殖；植物组织培养中常用根尖、茎尖等培养无病毒植物个体，而动物细胞培养的一个重要应用是检测有毒物质。
4．右图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据图回答：
(1)容器A中放置的是动物器官或组织，它一般取自_________________。
(2)容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是________，然后用____________酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是_________。
(3)培养首先在B瓶中进行，瓶中的培养基成分有__________________等。
在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这时培养到第________代，到这时的培养称为________。
(4)为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用________处理，然后配制成________，再分装。
(5)在C瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡，原因是___________________。
解析：进行动物细胞培养时所取材料一般为胚胎或幼龄动物的胚胎或组织，培养过程中需用胰蛋白酶处理，促使细胞分散开来；用于动物细胞培养的培养基成分可包括葡萄糖、氨基酸等有机营养、无机盐、动物血清等。正常细胞在分裂10次左右时往往停止分裂并最终死亡，发生癌变的细胞才能保持永久分裂能力。
答案：(1)胚胎或幼龄动物的器官或组织　(2)剪碎　胰蛋白　使细胞与培养液充分接触　(3)葡萄糖、氨基酸、无机盐和动物血清　10　原代培养　(4)胰蛋白酶　细胞悬浮液　(5)细胞没有发生癌变
考点三 动物细胞融合与单克隆抗体的制备(Ⅱ)
考情解读 　　单克隆抗体的制备在近几年新课标高考中考查较多，一般起点较高，而落点较低。预计今后的高考命题角度主要注重于细胞融合及单克隆抗体在医学实践中的应用。
[做一题]
[例3]　人绒毛膜促性腺激素(HCG)是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图，请分析回答下列问题：
(1)制备单克隆抗体过程中要用到________和________技术。
(2)制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的HCG相当于________，使小鼠产生能分泌相应________的淋巴细胞，此过程属于特异性免疫中的________免疫。
(3)在细胞内DNA合成一般有两条途径，主要途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基嘌呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。
①利用DNA合成途径不同的特点配制的HAT培养基含有多种成分，其中添加的________成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。
②最终筛选获得的杂交瘤细胞的特点是________________________________________。
(4)此过程生产的单克隆抗体可以与_____________________________________________
特异性结合，从而诊断早孕。
[解析]　制备单克隆抗体要用到动物细胞培养和动物细胞融合技术。给小鼠注射的HCG相当于抗原，小鼠经过体液免疫从而产生分泌相应抗体的B淋巴细胞。在培养基中加入氨基嘌呤可阻断细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸进而合成DNA的过程，从而抑制DNA通过此途径进行复制，因此用此种培养基进行筛选时，培养基中的骨髓瘤细胞的DNA复制过程被阻断，不能生长，而受抗原刺激后的淋巴细胞也不能增殖，则筛选出来的就都是杂交瘤细胞。
[答案]　(1)动物细胞培养　动物细胞融合　(2)抗原　抗体　体液　(3)①氨基嘌呤　②能无限增殖并分泌特异性抗体(必须答全)　(4)人绒毛膜促性腺激素(或HCG)
[链一串]
1．植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
植物体细胞杂交 动物细胞融合
细胞融合原理 细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 细胞膜的流动性
细胞融合方法 用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导原生质体融合 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散后，诱导细胞融合
诱导手段 离心、电刺激、振动、显微操作、聚乙二醇等诱导 与植物体细胞杂交相比，还可用灭活的病毒诱导
结果 获得杂种植株 获得杂种细胞，以生产细胞产品
用途 克服远缘杂交不亲和的障碍，扩展杂交亲本范围，培育新品种 制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等
相同点 ①两者在融合过程中都会发生多种融合方式，如A—A，B—B，A—B，因此要进行筛选②两者都要用到细胞融合和细胞培养两种技术手段
2．细胞融合两次筛选的目的及方法
(1)在特定的选择性培养基上，未融合的亲本细胞(B淋巴细胞和骨髓瘤细胞)和融合的具有同种核的细胞(BB融合细胞、瘤瘤融合细胞)都会死亡，只有融合的杂种细胞(杂交瘤细胞)才能生长。这种杂种细胞的特点是既能迅速大量繁殖，又能产生单一的特异性抗体。
(2)经选择性培养的杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞(很多种杂交瘤细胞)，需经克隆化培养和抗体检测，经多次筛选后可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
[关键一点]　抗体是由B淋巴细胞分泌的，每一种B淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体，要想得到大量的单一抗体，必须将同一种B淋巴细胞大量克隆，但在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞不能无限增殖，而骨髓瘤细胞可以在体外无限增殖，因此，通过细胞融合可得到既能分泌特异性抗体、又能无限增殖的杂交瘤细胞。
[通一类]
5．(2013·重庆高考)下图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述正确的是(　　)
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应T淋巴细胞
B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群
解析：选D　图示①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应B细胞(浆细胞)；胰蛋白酶常用在动物细胞培养过程中，其作用是使组织分散成单个细胞，图示②中应使用促融剂如聚乙二醇(PEG)；图示③为杂交瘤细胞，其同时具有浆细胞产生抗体的特性和骨髓瘤细胞无限增殖的特性；图示④是经筛选获得的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
6．根据单克隆抗体制备流程示意图判断以下选项中正确的是(　　)
A．单克隆抗体技术的原理包括细胞增殖、细胞膜的流动性、细胞的全能性等
B．根据培养基的物理性质分类，图中HAT培养基属于选择培养基
C．在制备单克隆抗体的过程中有两次筛选，第一次是筛选杂交瘤细胞，第二次是筛选能够产生高特异性抗体的杂交瘤细胞
D．小鼠骨髓瘤细胞染色体数是40，B淋巴细胞的染色体数为46，融合后形成的杂交瘤细胞DNA分子数为86
解析：选C　A项不能体现细胞的全能性；B项中选择培养基是按用途划分的；D项中融合的细胞的细胞质中也含有DNA分子。
一、选择题
1．下列有关植物细胞工程的叙述，正确的是(　　)
A．脱分化过程中植物细胞会失去其特有的结构和功能
B．再分化过程中只需要细胞分裂素作用即可
C．白菜与甘蓝均为二倍体，经体细胞杂交可得二倍体“白菜—甘蓝”新品种
D．植物体细胞杂交与动物细胞融合的方法完全一致
解析：选A　再分化过程中需生长素与细胞分裂素共同作用，只是细胞分裂素的效应高于生长素；因杂交细胞含有两个物种的四个染色体组，所以两种二倍体经体细胞杂交所得生物为异源四倍体；动物细胞融合可用灭活的病毒处理，而植物体细胞杂交不能。
2．(2013·重庆高考)某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉，其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽”。下列有关叙述，错误的是(　　)
A．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害
B．在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞
C．出芽是细胞再分化的结果，受基因选择性表达的调控
D．生根时，培养基通常应含α 萘乙酸等生长素类调节剂
解析：选B　植物组织培养中消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对培养材料的伤害；植物体细胞的杂交需先除去细胞壁得到原生质体，再在细胞融合诱导剂作用下获得染色体加倍的细胞；细胞分化的实质是基因的选择性表达；植物组织培养过程中，生根阶段的培养基中通常应含有生长素类调节剂。
3．细胞工程中，选择合适的生物材料是成功的关键。下列选择不合理的是(　　)
A．选择高度分化的动物体细胞进行培养有利于获得大量细胞
B．选择胚胎细胞作为核供体进行核移植可提高克隆动物的成功率
C．选择一定大小的植物茎尖进行组织培养可获得脱毒苗
D．选择植物的愈伤组织进行诱变处理可获得优质的突变体
解析：选A　培养动物细胞时，应该选择增殖能力强、分化程度低的组织或器官，如幼龄动物的组织。胚胎细胞的分化程度低，进行核移植能够提高克隆动物的成功率。植物茎尖由于没有病毒，通过植物组织培养可以获得脱毒苗。愈伤组织的分裂能力强，对其进行诱变处理后可获得优质的突变体。
4．下列关于动物细胞培养的叙述中，正确的是(　　)
A．动物细胞培养的目的就是为获得细胞分泌蛋白
B．动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散开
C．动物细胞培养通常不会出现接触抑制现象
D．可以通过细胞培养技术获得完整的动物个体
解析：选B　动物细胞的培养是为了获得更多的动物细胞，不同于植物组织培养，它无法获得完整动物个体。在培养之前对材料要用胰蛋白酶处理使细胞分散开，在培养过程中动物细胞会出现接触抑制现象。
5．下列与细胞工程技术相关的表述中，不正确的是(　　)
A．植物体细胞杂交技术可以克服常规的远缘杂交不亲和障碍
B．动物细胞培养与植物组织培养所用的培养基成分相同
C．动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同
D．植物组织培养技术的理论基础是细胞的全能性
解析：选B　植物体细胞杂交可以把来自不同植物细胞融合在一起，克服了自然状态下植物间远缘杂交不亲和障碍，融合后的细胞能培育成一个植物个体，体现了植物细胞全能性，细胞融合原理是膜的流动性，但植物细胞培养基除基本成分外还需要植物激素，动物细胞培养液还需要动物血清。
6．某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行动物细胞培养。下列说法正确的是(　　)
A．在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理
B．细胞培养过程中加入的O2和CO2作用相同
C．甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象
D．仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒
解析：选C　胃蛋白酶最适pH值接近于2，在酸性条件下作用强，而细胞培养液的pH值接近于中性，所以不能用胃蛋白酶处理。CO2的作用是调节细胞培养液的pH值，而O2是细胞代谢所必需的。由于存在细胞接触抑制现象，所以在原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象，需要传代培养获得细胞株和细胞系；病毒在活细胞内才能增殖，不能用培养细胞的培养液进行培养。
二、非选择题
7．将胚状体包埋在一个能提供营养的胶质中，便成了所谓的人工种子。其培育过程如图所示，请回答：
(1)人工种子依据的原理是________，经过________________技术培育而成的。
(2)包埋胚状体的胶质可以看做种子的哪部分结构？________________。
(3)如果外植体为植物的茎尖，通过①的处理可使细胞彼此分离，可加入______(填序号)。
A．蛋白酶　　　　　　　　　 B．淀粉酶
C．果胶酶 D．胰蛋白酶
(4)②表示脱分化过程，其实质是______________；③表示再分化的过程，其实质是_____。
(5)从上面所述胚状体的类型分析，人工种子萌发长成的植株是否可育？_____________。
解析：(1)人工种子能发育成完整的植株，说明其细胞内含有个体发育的全部遗传信息，因此依据的原理是细胞的全能性，经过植物组织培养得以表达。(2)包埋胚状体的胶质有保护胚状体的作用，同时又可以为胚状体提供营养物质，所以可以看做种皮及胚乳。(3)使植物细胞彼此分离可以使用果胶酶，因为植物细胞壁的主要成分是果胶。(4)脱分化实质上是恢复分裂能力，而再分化就是分化，其实质是基因的选择性表达。(5)由题目信息可知，人工种子的胚状体可来自茎尖、芽尖、子房、花粉等，如果来自花粉，得到的个体是单倍体，单倍体一般高度不育。
答案：(1)细胞的全能性　植物组织培养　(2)种皮及提供营养的胚乳或子叶　(3)C　(4)使细胞恢复分裂　基因的选择性表达　(5)若是由花粉(或三倍体植物的营养器官)发育而来的则不可育，若是由茎尖、根尖等营养器官发育而来的则可育
8．(2013·天津高考)花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病。野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图。
据图回答下列问题：
(1)过程①所需的酶是________________________________________________________。
(2)过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的________存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。
(3)原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是____。原生质体经过________再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。
(4)若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和________植株的根尖，通过________、________、染色和制片等过程制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目。
(5)采用特异性引物对花椰菜和黑芥基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1～4进行PCR 扩增的结果。据图判断，再生植株1～4中一定是杂种植株的有____________________。
(6)对杂种植株进行________接种实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
解析：图中(1)过程①是获得黑芥叶肉细胞的原生质体和花椰菜根细胞的原生质体，该过程需用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。(2)供体细胞为黑芥叶肉细胞含有叶绿体，而受体花椰菜的根细胞无叶绿体，因此可以根据叶绿体的有无初步筛选出杂种细胞。(3)加入甘露醇以保持渗透压，是为了维持原生质体的完整性，防止原生质体吸水涨破。原生质体再生出细胞壁，经过脱分化形成愈伤组织。(4)若分析再生植株的染色体变异类型，需将再生植株细胞的染色体与亲本即黑芥和花椰菜的染色体进行比较；观察染色体的形态和数目需在有丝分裂中期观察，因此需要经过解离、漂洗、染色、制片等过程制成装片。(5)杂种植株需含有双亲的遗传物质，分析图形可知，再生植株1、2、3、4均含有花椰菜的DNA，其中1含有黑芥的全部DNA,2、4含有黑芥的部分DNA，而3不含有黑芥的DNA，因此1、2、4一定是杂种植株。(6)为培育具有抗黑腐病的杂种植株，需对得到的杂种植株进行黑腐病菌接种实验，观察其是否患病，不患病的即为高抗性的杂种植株。
答案：(1)纤维素酶和果胶酶　(2)叶绿体　(3)保持原生质体完整性　细胞壁　(4)双亲(或花椰菜和黑芥)　解离　漂洗　(5)1、2、4　(6)黑腐病菌
9．(2014·泉州质检)狂犬病的病原体为RNA病毒，其表面的G蛋白可作为主要抗原用于制备狂犬病疫苗。研究人员利用生物工程技术培育出转G基因番茄，实现G蛋白的大量生产。其基本技术流程如下图。请回答：
MN
(1)图中，过程①称为________________；过程②采用最多的方法是_________________。
(2)图中，N称为_______________________；过程③称为_________________________。
(3)食用G基因已有效表达的转基因番茄果实________(填“能”或“不能”)预防狂犬病。
解析：(1)因为M能通过PCR获得G基因，所以M为基因，过程①称为反转录(或逆转录)，基因表达载体导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。(2)分化的番茄细胞通过脱分化得到N称为愈伤组织，然后再通过过程③再分化得到胚状体。(3)食用G蛋白会破坏蛋白质的结构，所以不能预防狂犬病。
答案：(1)反转录(或逆转录)　农杆菌转化法
(2)愈伤组织　再分化 (3)不能
10．科学家通过转基因技术获得了含有人生长激素基因的奶牛，如果要加速转基因奶牛的繁育，可以对此转基因奶牛进行克隆(如下图所示)，请结合图示回答下列问题：
(1)在进行细胞培养时，要对取自转基因奶牛的组织细胞进行分散处理，形成单个细胞，这个过程中需要利用________酶处理。
(2)形成重组细胞时应选用________期的卵母细胞，去掉其细胞核的原因是__________。
(3)如果重组细胞为贴附性细胞，则在进行原代培养时，会表现出________和__________等特点。
(4)图中犊牛并非是对体细胞核供体母牛100%的复制，其主要原因是_______、________。
(5)上图中所示的生物技术整体被称为________。其包括的具体生物技术有________、________等。转基因奶牛的克隆成功，说明了动物________________具有全能性。
解析：(1)胰蛋白酶可以水解动物细胞间的蛋白质成分，使细胞相互分离。(2)利用核移植形成重组细胞时需要用发育至减Ⅱ中期的卵母细胞，若不对其做去核处理，重组细胞的遗传物质含量就不正常。(3)贴附性细胞表现出贴壁生长的特性，并且会出现接触抑制现象，故要定期用胰蛋白酶将贴壁生长的细胞从瓶壁上分离下来。(4)重组细胞的遗传物质源于体细胞的细胞核和卵细胞的细胞质，同时生长环境对其表现型也有影响。(5)图示为体细胞核移植技术，所包括的技术有动物细胞培养、胚胎移植等。转基因奶牛培育成功，说明动物体细胞核具有全能性。
答案：(1)胰蛋白(或胶原蛋白)
(2)减Ⅱ中　使克隆出的动物个体的遗传物质几乎全部来自供体细胞(或“避免卵细胞中的遗传物质对后代造成干扰”，其他合理答案也可)
(3)贴壁生长(或细胞贴壁)　接触抑制(两空顺序可以颠倒)
(4)生物的性状受细胞核基因和细胞质基因共同控制　生物的性状还受环境因素的影响(两空顺序可以颠倒，其他合理答案也可)
(5)核移植(或体细胞核移植)　细胞培养　胚胎移植　体细胞的细胞核
11．下图是制备分泌抗X抗体的过程，根据图解回答问题：
(1)给小鼠注射抗原的目的是________________________________________________。
(2)在单克隆抗体制备过程中之所以选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，是因为它们融合后的杂交瘤细胞具有______________________________的特性。
(3)由图中可看出，单克隆抗体制备过程运用了______________和________________的动物细胞工程技术手段，前者常用的与植物原生质体融合不同的诱导剂是____________。
(4)动物细胞培养液的配方通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素等，与植物细胞培养基有所不同的是，还含有____________。
(5)在动物细胞融合过程中，需要将所选取的组织细胞离散开，以利于细胞融合，可用____________处理所选组织细胞使之分散开。
(6)图中有两次筛选过程，其中步骤④的目的是筛选出______________，步骤⑤⑥的目的是筛选出________________________。
(7)请根据以下信息，设计一方法(不考虑机械方法)从培养液中筛选出杂交瘤细胞。已知细胞合成DNA有D和S两种途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖；鼠骨髓瘤细胞中虽然没有S途径，但能不断分裂增殖。将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。
方法：______________________________________________________________________
__________________________________________________________________________。
原理：______________________________________________________________________
__________________________________________________________________________。
解析：单克隆抗体的制备过程中，将已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，已免疫的B淋巴细胞的获得要求给小鼠注射抗原；形成的杂交瘤细胞既具备B淋巴细胞能产生特异性抗体的特点，也具备了骨髓瘤细胞能无限增殖的特点；单克隆抗体的制备过程利用了动物细胞融合和动物细胞培养技术，和植物体细胞杂交的不同之处是可利用灭活的病毒为诱导剂；使组织分散成单个细胞可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理；在制备单克隆抗体的过程中出现两次筛选，第一次的目的是选出杂交瘤细胞，第二次的目的是从杂交瘤细胞中选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
答案：(1)获得能产生相应抗体的B淋巴细胞
(2)既能无限增殖，又能产生特定抗体
(3)动物细胞融合 动物细胞培养 灭活病毒
(4)动物血清 (5)胰蛋白酶
(6)杂交瘤细胞 能产生特定抗体的杂交瘤细胞
(7)方法：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞
原理：加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖
第三讲　胚胎工程(教材专题3)
　　
一、胚胎工程的含义
胚胎工程指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需要移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。
二、体内受精和早期胚胎发育
1．精子产生的场所、时期与过程
(1)场所：睾丸的曲细精管。
(2)时期：初情期开始，直到生殖机能衰退。
(3)过程：
2．卵子的发生
(1)场所：卵巢。
(2)时期：胎儿期和初情期后。
(3)过程(如图)：
(4)两次分裂的时间：减数第一次分裂是在雌性动物排卵前后完成的，减数第二次分裂是在精子和卵子结合的过程中完成的。
3．受精过程
(1)受精作用：精子与卵子结合形成合子的过程。
(2)受精作用发生的场所：输卵管；刚排出的精子能否立即受精？不能。
(3)受精过程：
准备阶段
受精阶段
4．胚胎发育过程
(1)哺乳动物早期胚胎发育(以人为例)：
①胚胎发育开始场所：输卵管。
②进入子宫时期：桑椹胚期。
③着床时期：囊胚期。
(2)胚胎发育过程：
受精卵→卵裂→桑椹胚→囊胚→原肠胚→组织器官的发育
①卵裂期：在透明带内进行有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎总体积并不增加，或略有减少。
②桑椹胚：由具有全能性细胞构成，细胞数在32个左右，排列紧密，形似桑椹。
③囊胚：细胞出现分化
④原肠胚：出现胚层的分化。
二、体外受精和早期胚胎培养
1．体外受精
(1)卵母细胞的采集和培养：
①对于小型实验动物；常采用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子。
②对于大型动物或大家畜(如牛)：一般从已屠宰或活体母畜的卵巢中采取。
(2)精子的采集和获能
(3)受精：获能的精子和培养成熟的卵子一般在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精作用。
2．早期胚胎培养
(1)培养液成分
(2)胚胎处理：向受体移植或冷冻保存。
三、胚胎工程的应用及前景
1．胚胎移植
(1)概念：将雌性动物的早期胚胎，或者通过其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之发育为新个体的技术。
(2)胚胎移植的实质：是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程。
(3)过程：
(4)意义：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜能。
2．胚胎分割
(1)概念：采用显微手术(机械方法)的方法将早期胚胎分割成2分胚，4分胚或8分胚，经体内或体外培养后植入受体，以得到同卵双胎或同卵多胎的技术。
(2)材料：发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。
(3)实质：胚胎分割可增加动物后代数量，其实质是动物的无性繁殖或克隆。
(4)对囊胚阶段的胚胎分割时要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
3．胚胎干细胞
(1)胚胎干细胞的来源和特点：
①来源：从早期胚胎或原始性腺中分离而来。
②特点
(2)胚胎干细胞的应用价值：
①治疗人类某些顽症。
②培育人造组织器官。
③研究体外细胞分化的理想材料。
考点一 精子、卵子的发生与受精作用(Ⅰ)
考情解读 　　对本考点的考查主要以简答题的形式呈现，常结合试管动物的培育过程、受精作用发生的条件及时期进行考查，此外对精子及卵细胞的发生过程也有较多考查。预计今后高考还会对相关内容进行考查。
[做一题]
[例1]　下图表示高等动物卵子的发生过程，请据图回答有关问题：
(1)图中A是________，B是________，E(过程)是指____________，阶段C是指个体发育的________(时期)，阶段D是指个体发育的________(时期)。
(2)当观察到第二极体时，可以表明________________。
(3)能发生染色体的着丝点分裂的阶段是________。(填序号)
(4)①阶段存在的变异方式是____________________。
[解析]　本题考查卵子形成过程中的有关知识。(1)图中①为有丝分裂，可增加卵原细胞的数量，卵原细胞进一步演变为初级卵母细胞；③、④为减数分裂，只有在受精后，次级卵母细胞才能最终完成减数第二次分裂，因此E是受精，B是合子；卵泡的形成是在胎儿期，减数分裂是从初情期开始的，因此阶段C为胎儿期；阶段D为初情期后。(2)当观察到第二极体时，表明卵子已经完成了受精作用。(3)着丝点分裂可发生在有丝分裂中，也可发生在减数第二次分裂中，因此为①、④。(4)有丝分裂中的变异类型只有基因突变、染色体变异，没有基因重组。
[答案]　(1)第一极体　合子　受精　胎儿期　初情期后　(2)卵子已经完成了受精　(3)
①、④　(4)基因突变、染色体变异
[链一串]
1．精子、卵子发生的比较
项目 精子发生 卵子发生
区别 场所 睾丸的曲细精管 卵巢(MⅠ)、输卵管(MⅡ)
开始时间 初情期后 胚胎性别分化后
过程特点 ①MⅠ、MⅡ是连续的②需要变形③两次细胞质分裂均等 ①MⅠ、MⅡ是不连续的②不需要变形③两次细胞质分裂不均等
结果 形成4个精细胞 形成1个卵细胞
相同点 ①原始生殖细胞的增殖方式为有丝分裂②生殖细胞的成熟经减数分裂完成③成熟过程均经一次复制和两次分裂，子细胞染色体数目减半
2.卵细胞只允许同种单个精子完成受精的保障
(1)同种生物精卵结合的保障：
卵细胞透明带上存在精子的特异识别受体，只允许同种生物的精子与卵细胞结合。
(2)防止多精入卵的保障：
①单个精子穿过透明带，触及卵细胞膜的瞬间引发透明带反应，透明带蛋白质变性成为较坚韧的一层，阻止其他精子进入，这是防止多精入卵的第一道屏障。
②单个精子穿过卵细胞膜入卵后，立即引发卵细胞膜反应，拒绝其他精子再进入卵细胞，这是防止多精入卵的第二道屏障。
(3)受精的标志和受精完成的标志：
①受精标志：在透明带和卵细胞膜之间观察到两个极体。
②受精完成的标志：雌、雄原核的融合。
3．早期胚胎发育
(1)过程：受精卵→卵裂期→桑椹胚→囊胚→原肠胚
(2)图示：
[关键一点]　受精阶段——四步曲
第一步：精子穿越放射冠和透明带。顶体反应使顶体内的酶释放出来并溶解放射冠内的卵丘细胞之间的物质，透明带反应是防止多精入卵受精的第一道屏障。
第二步：精子进入卵细胞膜。卵细胞膜反应是防止多精入卵受精的第二道屏障。
第三步：原核形成。雄原核形成和雌原核形成。
第四步：合子形成。雌雄原核融合形成合子(受精卵)。
[通一类]
1．下列有关哺乳动物精子和卵细胞的发生以及受精作用的叙述，正确的是(　　)
A．采集到的精子和卵细胞相遇即可发生受精作用
B．排卵就是排出成熟卵细胞的过程
C．卵细胞形成时的分裂过程均在卵巢内完成
D．卵子受精完成的标志是在卵细胞膜和透明带之间观察到两个极体
解析：选D　采集到的精子必须经获能处理后才能受精；采集的卵细胞分两种情况：若是从输卵管中冲取卵子则不需要培养直接就可以与获能的精子受精，若从卵巢中取出的卵细胞则需要培养成熟后才可以与获能的精子受精。排卵排出的可能是初级卵母细胞或次级卵母细胞而不是成熟的卵细胞；哺乳动物卵细胞形成的场所：未排卵之前是在卵巢中进行的，排卵之后，减数第二次分裂的完成是在输卵管中进行的。
2．(2012·浙江高考)下列关于高等哺乳动物受精与胚胎发育的叙述，正确的是(　　)
A．绝大多数精卵细胞的识别具有物种特异性
B．卵裂球细胞的体积随分裂次数的增加而不断增大
C．囊胚的滋养层细胞具有发育全能性
D．原肠胚发育分化形成内外两个胚层
解析：选A　同种动物的精卵细胞的表面有特异性相互识别的蛋白，这是同种动物的精卵能结合的原因之一；受精卵不断进行细胞分裂即卵裂，卵裂产生的细胞团称卵裂球，随着卵裂球体积的增大，细胞逐渐变小；滋养层细胞不具有发育的全能性，即不能分化出成体动物的所有组织和器官；原肠胚发育分化会形成各种器官原基。
考点二 体外受精和早期胚胎培养(Ⅰ)
考情解读 　　胚胎工程中的卵母细胞及受精卵的培养、胚胎分割及胚胎干细胞培养等技术与“基因工程”“细胞工程”等现代生物科技专题有着密切联系，可以说“动物基因工程”“动物细胞工程”等是胚胎工程的上游技术，而胚胎工程则属于下游技术。随着新课标高考的深入，预计对本考点内容的考查将会增多。
[做一题]
[例2]　下图表示利用胚胎工程培育优质奶牛的基本流程：
―→―→―→
―→―→―→―→
(1)桑椹胚是胚胎细胞数目为________个左右的胚胎，这个阶段的每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜力，属于________。补充填写胚胎发育的几个重要阶段：受精卵―→桑椹胚―→________―→________。优质奶牛的培育过程需要进行胚胎移植，移植后的胚胎能在受体子宫中存活，其生理基础是________________________。
(2)在优质奶牛的培育过程中，为了能够快速繁殖，常用体外受精技术，其过程为：
该过程中卵母细胞可以直接在体外受精吗？________(“能”或者“不能”)，在进行体外受精前要对精子进行________处理。
(3)若要同时获得多头与此优质奶牛相同的小牛，可进行胚胎分割。应选择发育到________时期的胚胎进行操作，进行分割时，应注意将________分割，通过胚胎分割产生的两个或多个个体具有相同的______。
(4)胚胎干细胞(简称ES细胞或EK细胞)是由________胚胎或者原始性腺中分离出来的一类细胞。具有很强的________能力和多向________的潜能。ES细胞将会给人类移植医学带来一场革命，原因是ES细胞可以被诱导分化形成新的________，还可以培育出新的________。
[解析]　(1)桑椹胚的胚胎细胞数为32个左右，这些细胞属全能细胞；移植后的胚胎能在受体子宫中成活的生理基础是受体子宫对外来胚胎不发生排斥反应。(2)在进行体外受精时，卵母细胞需在体外培养成熟后方可与获能的精子受精。(3)进行胚胎分割移植最好选桑椹胚或囊胚予以分割。(4)胚胎干细胞是由早期胚胎或原始性腺中分离出的一类细胞，ES细胞可以被诱导分化成新的组织细胞，还可培育出新的组织器官。
[答案]　(1)32　全能细胞　囊胚　原肠胚　受体子宫对外来胚胎不发生排斥反应　(2)不能　获能　(3)桑椹胚或囊胚　内细胞团均等　遗传物质　(4)早期　增殖　分化　组织细胞　组织器官
[链一串]
1．体外受精
获能的精子和成熟后的卵细胞在体外合适的环境下共同培养一段时间才能完成受精；受精后形成的受精卵需经早期发育培养，才能完成植入或着床，如下图所示：
2．胚胎移植的生理学基础
(1)哺乳动物排卵后，同种供受体生殖器官的生理变化是相同的，这是胚胎能够移入受体的生理基础。
(2)早期胚胎形成后，未与母体子宫建立联系，而是处于游离状态，这是胚胎收集的生理基础。
(3)受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，这是胚胎在受体内能够存活的生理基础。
(4)供体胚胎可与受体子宫建立联系，且不影响供体胚胎的遗传特性，这是供体胚胎正常发育的生理基础。
3．胚胎移植的实质
是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换，而胚胎本身的遗传物质并不会改变，因此各种性状能保持其原来的优良特性。
4．胚胎移植的优势
充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，从而大大缩短了供体本身的繁殖周期，大大推动了畜牧业的发展。
[关键一点]
(1)胚胎移植成功与否要具备的两个条件：
①胚胎移植一般应在同种的雌性供体和受体之间进行。
②进行胚胎移植的供体和受体的生理状态要相同。
(2)同种动物之间进行胚胎移植易于成功。这里的“同种”是指“同物种”。
(3)不同动物其胚胎移植的时间不同。牛、羊要培养到桑椹胚或囊胚阶段；小鼠、家兔在桑椹胚前；人胚胎可在4个细胞阶段移植；几乎所有动物不能到原肠胚阶段移植，因为此时分化程度高，移植成功率很低。
[通一类]
3．(2013·江苏高考)软骨发育不全为常染色体显性遗传病，基因型为HH的个体早期死亡。 一对夫妻均为该病患者，希望通过胚胎工程技术辅助生育一个健康的孩子。下列做法错误的是(　　)
A．首先经超排卵处理后进行体外受精
B．从囊胚中分离细胞，培养后检测基因型
C．根据检测结果筛选基因型为hh的胚胎
D．将胚胎培养至原肠胚期后移植到子宫
解析：选D　通过胚胎工程辅助生育是利用试管婴儿技术，首先需经超数排卵处理获得卵子，再与获能的精子进行体外受精；因健康孩子的基因型是hh，故需进行基因型检测；对人类来说，早期胚胎培养至桑椹胚或囊胚阶段即可移植。
4．下图为牛胚胎移植的基本程序，请据图回答：
(1)图中a、b、c过程分别是指____________________、__________、________。
(2)在胚胎移植过程中，供、受体母牛选择好后，要用激素进行同期发情处理，这样处理的原因是______________________________，以保证移植的胚胎能够继续正常发育。
(3)从哺乳动物早期胚胎或原始性腺中分离出来的细胞，称为ES或EK细胞，这类细胞的形态特征为__________________________________。
解析：(1)图中a、b、c依次指超数排卵、胚胎收集、胚胎移植。(2)同期发情处理的目的在于使供受体动物处于相同生理状态，以免发生免疫排斥反应。(3)胚胎干细胞具有体积小、细胞核大、核仁明显的特点。
答案：(1)超数排卵　胚胎收集　胚胎移植　(2)使供、受体的生理状态相同　(3)体积小、细胞核大、核仁明显
考点三 胚胎分割和胚胎干细胞(Ⅱ)
考情解读 　　本考点命题以简答题为主，多以图解的形式呈现。主要与畜牧生产和医学实践的应用及与科技发展相联系进行考查，“高起点，低落点”是相关考题的特点，以最新的胚胎工程和干细胞培养的研究成果为背景，对获取信息的能力和综合应用知识的能力进行考查将可能成为今后高考的热点，备考时应予以关注。
[做一题]
[例3]　下图为牛胚胎性别鉴定和分割示意图，请据图完成下列问题：
(1)填出图中字母所代表的结构名称：
A．________；B.________；C.________；D.________；
(2)写出甲、乙、丙过程的技术名称：
甲________；乙________；丙________；进行乙过程时，所取的样本是______________。
(3)进行甲过程时，所使用的基本仪器是________，本过程的技术关键是_____________。
(4)尽管胚胎分割技术在多种动物中取得成功，但仍然存在一些问题，如刚出生的动物体重偏轻，毛色和斑纹上还存在差异等，同时很难取得同卵多胎，成功率较高的是________。
[解析]　(1)根据囊胚的结构可知图中字母所代表的结构名称分别是：A为囊胚腔；B为透明带；C为滋养层；D为内细胞团。(2)图中表示的甲、乙、丙过程的技术分别是胚胎分割、做DNA分析性别鉴定、胚胎移植。进行乙过程时，所采取的样本是滋养层细胞。(3)进行甲过程时，所使用的基本仪器是显微操作仪和实体显微镜。本过程的技术关键是将内细胞团均等分割。(4)尽管胚胎分割技术在多种动物中已取得成功，但仍然存在一些问题，如刚出生的动物体重偏轻，毛色和斑纹上还存在差异等。同时很难取得同卵多胎，成功率较高的是同卵双胎。
[答案]　(1)囊胚腔　透明带　滋养层细胞　内细胞团
(2)胚胎分割　做DNA分析性别鉴定　胚胎移植　滋养层细胞
(3)显微操作仪和实体显微镜　将内细胞团均等分割
(4)同卵双胎
[链一串]
1．干细胞的类型
类别 举例 特点
全能干细胞 胚胎干细胞 能发育成完整个体
多能干细胞 造血干细胞 能分化成多种细胞，但无发育成完整个体的能力
专能干细胞 上皮组织底层的干细胞 只能分化形成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞
2．干细胞的培养过程
3．胚胎干细胞的主要用途
(1)克隆动物培育：
将胚胎干细胞核移植到去核的卵细胞中，经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接由受体完成克隆动物，操作流程如下：
(2)基因敲除，获得移植器官。
(3)培育出人造组织器官，用于器官移植。
(4)改良创造动物新品种。
[关键一点]　干细胞的培养需要一种能促进胚胎干细胞的生长、但抑制其分化的一种培养体系，这种体系就是胚胎成纤维细胞。
[通一类]
5．(2012·江苏高考)通过胚胎移植技术，可以实现良种牛的快速繁殖。下列相关叙述正确的是(　　)
A．对供体和受体母牛都要进行相同激素处理
B．受精和胚胎的早期培养都需要在体外进行
C．对冲卵获得的原肠胚检查合格后方可移植
D．胚胎分割移植实现同卵多胎的成功率较低
解析：选D　在胚胎移植时，需用促性腺激素对供体母牛进行超数排卵处理，而受体母牛则不需要；胚胎移植技术中，移植的胚胎也可来自体内受精发育形成的受精卵；移植的胚胎不能用原肠胚，而应是发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚，某些生物可在更早的阶段移植；目前以二分胚胎的分割和移植效率最高，而同卵多胎的成功率较低。
6．(2013·山东高考)科学家通过诱导黑鼠体细胞去分化获得诱导性多能干细胞(iPS)，继而利用iPS细胞培育出与黑鼠遗传特性相同的克隆鼠。流程如下：
(1)从黑鼠体内获得体细胞后，对其进行的初次培养称为________，培养的细胞在贴壁生长至铺满培养皿底时停止分裂，这种现象称为________。
(2)图中2 细胞胚胎可用人工方法从灰鼠输卵管内获得，该过程称为________；也可从灰鼠体内取出卵子，通过________后进行早期胚胎培养获得。
(3)图中重组囊胚通过________技术移入白鼠子宫内继续发育，暂不移入的胚胎可使用________方法保存。
(4)小鼠胚胎干细胞(ES)可由囊胚的________分离培养获得。iPS与ES细胞同样具有发育全能性，有望在对人类iPS细胞进行定向________后用于疾病的细胞治疗。
解析：(1)原代培养指将动物组织用酶处理成单个细胞后进行的初次培养。接触抑制指贴壁的细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。(2)将早期胚胎从母体子宫中冲洗出来叫冲卵。(3)暂不进行胚胎移植的胚胎可放入－196 ℃的液氮中保存。(4)iPS与ES细胞一样，可通过诱导定向分化修补某些功能异常的细胞来治疗疾病。
答案：(1)原代培养　接触抑制　(2)冲卵(或：冲胚) 　体外受精(或：核移植)　(3)胚胎移植　冷冻(或：低温)　(4)内细胞团　诱导分化
一、选择题
1．下列不是精子、卵细胞发生的区别是(　　)
A．初级精母细胞、初级卵母细胞的形成时间
B．减数第一次分裂和减数第二次分裂的时间连续性
C．成熟生殖细胞是否经过变形
D．成熟生殖细胞中染色体的数量
解析：选D　初级精母细胞是雄性动物初情期开始后，才由精原细胞分裂形成的，而初级卵母细胞是在胎儿期形成的；精子的产生在减数第一次分裂和减数第二次分裂是连续的，而卵细胞产生通过减数第一次分裂形成次级卵母细胞，在精子和卵子的结合过程中才完成减数第二次分裂；精子细胞形成后变形为蝌蚪状，卵细胞不需变形；成熟的精子和卵细胞经过减数分裂形成，都含有亲本细胞一半的染色体数目。
2．下面是试管婴儿培育过程示意图。有关叙述不正确的是(　　)
A．过程①中可通过注射促性腺激素增加排卵数量
B．过程②需要在添加ATP的获能液中完成
C．过程③的培养液中应该添加动物血清
D．过程④成功的条件之一是受体对供体胚胎没有排斥
解析：选B　精子获能液是一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液。
3．下图表示哺乳动物胚胎发育过程的几个阶段，下列相关描述正确的是(　　)
A．图中3是透明带，7是原

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