资源简介

(共62张PPT)
1.29 基因工程
一.概念
科学探究：基因工程的诞生和发展
二.原理：基因重组
三.理论基础
四.优点
克服远缘杂交障碍
可定向改造生物的性状
五.工具
1.限制酶——“分子手术刀”
来源②特点③作用部位④作用结果
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
作用②种类
3.载体——“分子运输车”
作用②种类③作为载体的条件
科学探究：DNA的粗提取与鉴定
1.29 基因工程
六.操作程序
目的基因的筛选与获取
科学思维：PCR技术获取和扩增目的基因
概念、原理、目的、优点、操作环境、条件、过程、结果
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
探究实践：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
七.应用
八.第二代基因工程
——蛋白质工程
原理
应用
76 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
苏云金杆菌内获得Bt抗虫蛋白基因
与载体结合
转入
棉花内
检查转基因抗虫棉是否培育成功
基因表达载体的构建（核心）
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
目的基因的概念
例如：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（Bt基因、胰岛素基因等）
目的基因的筛选与获取
目的基因的概念
目的基因的结构
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区
组成：编码区上游与编码区下游
功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
启动子：位于基因首端一段有特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。没有启动子，基因就不能转录。
终止子：位于基因的下游的一段特殊的DNA片段，使转录终止。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质。
非编码区
非编码区
启动子：
编码区
原核生物基因
终止子：
目的基因的筛选与获取
目的基因的概念
目的基因的结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子：
外显子：
真核细胞的基因结构
编码序列：
不包括非编码区（启动子、终止子）和内含子
【成熟的mRNA中对应内含子的片段脱落】
转录
加工
前体mRNA
成熟的mRNA
翻译
蛋白质
目的基因的筛选与获取
目的基因的概念
目的基因的结构
目的基因的筛选
方法：
从相关的________和_________的基因中进行筛选
已知结构
功能清晰
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能
实例：
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程
苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt抗虫蛋白基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR是_______________的缩写，是一项根据______________的原理，在____提供参与DNA复制的 与 ，对____________________进行________的技术；
概念:
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
全称：
原理：
操作环境：
目的：
优点：
结果：
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
课本P77
以指数形式（2n）扩增目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
课本P77
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
发明者:
课本P86 历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献
PCR从畅想到实现，真的就是穆里斯一个人的功劳吗？其实这里也有中国人的贡献。
1972年，穆里斯在加州大学伯克利分校获得有机合成专业博士学位。1979年，他进入“西特斯”（Cetus)生物技术公司任职，负责合成供实验用的寡核苷酸（短链的DNA分子）。1983年8月，他首次在公司里做了有关PCR原理的报告，但大家反应冷淡，认为这个原理太简单了，如果可行，早就有人做了。
1986年5月，穆里斯经公司主管向沃森推荐，第一次受邀在一次“人类分子生物学”专题研讨会上做了PCR原理及实验应用的报告，这形成了先入为主的印象，即PCR是穆里斯一人发明的，为此，1993年穆里斯获得诺贝尔化学奖。然而，将PCR变成真正成熟技术的“临门一脚”，则是由中国科学家钱嘉韵完成的，是她发现并分离了耐高温的DNA聚合酶。
钱嘉韵是我国台湾的科学家，她是第一个报道分离耐高温DNA聚合酶工作的人。1973年，钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛辛那提大学生物系，她的导师对在黄石国家公园热泉中发现的嗜热菌十分好奇，他让钱嘉韵以该菌作为研究对象。钱嘉韵不负师望，从该菌中成功地分离了耐高温的DNA聚合酶，并于1976年在《细菌学杂志》上以第一作者身份发表了相关论文。这篇论文在科学界被广泛引用。 “西特斯”公司的工作人员正是按照钱嘉韵等人发明的操作步骤，才成功地分离了这种DNA聚合酶，并将其用于PCR。该酶不但专里斯一人发明的，为此，1993年穆里斯获得专一性和活性优于之前使用的DNA聚合酶，而且它使PCR变得十分简捷，大大降低了成本。自此，PCR被逐渐推广应用。
利用PCR获取和扩增目的基因
概念:
课本P77
条件：
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
（体外用高温代替）
（2种）
引物是一小段能与________的一段碱基序列________的____________
DNA母链
互补配对
短单链核酸
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
（dNTP）
引物
利用PCR获取和扩增目的基因
概念:
课本P78
过程：
条件：
引物
DNA模板
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
①变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
②复性
（+引物）
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
③延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
缓冲溶液
（含Mg2+)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
利用PCR获取和扩增目的基因
概念:
课本P78
过程：
条件：
上一轮循环的产物作为下一轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生下一轮循环的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
在PCR扩增仪中自动完成的。
3次循环能得到只含目的基因的片段
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开
50℃左右，引物与DNA结合
72℃左右，新DNA合成
3’
5’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3次循环能得到只含目的基因的片段
第
二次
循
环
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性、低温复性
5’
3’
5’
5’ 3’
3’ 5’
3’
5’
5’
3’
5’ 3’
3’ 5’
3’
3次循环能得到只含目的基因的片段
中温延伸
第
二次
循
环
3’
5’
高温变性、低温复性
3次循环能得到只含目的基因的片段
第
三次
循
环
3’
5’
中温延伸
3次循环能得到只含目的基因的片段
第
三次
循
环
3’
5’
√
√
需要引物2n+1-2
3次循环能得到只含目的基因的片段
利用PCR获取和扩增目的基因
概念:
课本P78
过程：
条件：
DNA（目的基因）模板。
分别与模板DNA相结合的两种引物。
A、T、G、C四种脱氧核苷酸。
耐高温的DNA聚合酶。
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
不同的温度：因为变性、复性和延伸需要不同温度
目的基因DNA 后 ;
与单链相应 结合；
然后以_________为模板在 作用下进行_______，即将4种___________加到_____________，如此______________。
每次循环一般可以分为_______、______、_______三步。
受热变性
解为单链
引物
延伸
互补序列
单链DNA
耐高温的DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
重复循环多次
变性
复性
延伸
思考讨论：1.变性过程破坏的是哪种化学键？是否需要酶？
氢键；不需要解旋酶，需要90℃以上的高温
2.引物是什么？在复性过程中引物结合到模板链的哪一端？
短单链核酸； 3’端
3.PCR为什么需要引物？
DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链
（DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羟基上）
4.引物长度有什么要求？
一般20-30个核苷酸，不能太短，为了特异性结合目的基因。
5.PCR扩增的结果:DNA数目呈______________
若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次需要引物的数目为 个。
若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。
利用PCR获取和扩增目的基因
概念:
课本P78
过程：
条件：
指数形式扩增
2n+1-2
N0 2n
课本P79
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 条件 延伸方向 不同点 解旋方式
场所
延伸用酶
温度
过程
结果
碱基互补配对
DNA母链作为模板、引物(体内引物mRNA、体外引物DNA）、4种脱氧核苷酸为原料
90℃以上高温解旋
解旋酶催化
PCR扩增仪
主要在细胞核
耐高温的DNA聚合酶
DNA聚合酶
需要在不同温度下进行（90℃以上变性、50℃左右复性、72℃左右延伸）
体内温和条件
大量的DNA片段（目的基因）
形成完整的子代DNA
新链都是从5’端向3’端延伸
DNA体内复制与体外复制（PCR技术）条件的比较
PCR
操作环境
目的
过程
条件
结果
变性
复性
延伸
1.模版
4.两种引物
2.四种原料【dNTP】
概念
原理
利用PCR获取和扩增目的基因
优点
在短时间内大量扩增目的基因
3.耐高温的DNA聚合酶
5.缓冲溶液
6.不同的温度
基因表达载体的构建【核心】
大肠杆菌如何分泌人的胰岛素？
剪切
→ 拼接
→导入
→ 表达
课本P80
将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
这种方法针对性差，完全靠运气，无法确定哪些基因导入了受体细胞，也无法保证目的基因能表达。
将获得的目的基因直接导入受体细胞可以吗？
基因的表达需要启动子和终止子等结构。启动子和终止子有特异性：比如人的胰岛素基因要在大肠杆菌中表达，就需要大肠杆菌的启动子。
基因表达载体的构建【核心】
当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达
构建基因表达载体的目的：
1.让目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；
2.使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的组成
终止子
启动子
目的基因
标记基因
复制原点
基因
表达载体
1.启动子：
一段有特殊序列结构的____片段
DNA
①本质：
②位置：
位于基因的____，紧挨____________
上游
转录的起始位点
③功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
诱导型启动子：
大肠杆菌如何分泌人的胰岛素？
剪切
→ 拼接
→导入
→ 表达
课本P80
基因表达载体的构建【核心】
终止子
启动子
目的基因
标记基因
复制原点
基因
表达载体
大肠杆菌如何分泌人的胰岛素？
剪切
→ 拼接
→导入
→ 表达
课本P80
2.终止子：
①本质：
一段有特殊序列结构的____片段
DNA
②位置：
位于基因的_____
下游
③功能：
使转录在所需要的地方停下来
3.标记基因：
①作用：
便于重组DNA分子的筛选
4.目的基因：
②常见类型：
抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
如Bt基因。
5.复制原点：
使能完成自主复制
基因表达载体的组成
1.启动子：
启动子 终止子 起始密码子
终止密码子
位置
作用
识别 结合
基因表达载体的构建【核心】
DNA
mRNA
转录
翻译
载体≠表达载体：
相同点：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。
区别：表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
2个易错点再强调
RNA聚合酶
核糖体
基因表达载体的构建【核心】
构建基因表达载体的目的：
基因表达载体的组成
课本P80
构建基因表达载体的过程：
重组DNA分子
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
连接酶
基因表达载体构建模式图
限制酶
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
质粒
同种限制酶,或能产生相同末端的限制酶
？
同一种限制酶切割获得的目的基因和载体混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有：
自身环化
两两连接
目的基因自身环化
载体自身环化
目的基因与目的基因连接
载体与载体连接
目的基因与载体连接
实际应用中往往选择2种不同的限制酶分别切割，减少自连情况出现；
应用标记基因对重组DNA进行筛选。
A
B
AA
BB
AB
将目的基因导入受体细胞
剪切
→ 拼接
→导入
→ 表达
课本P80
常用方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
—显微注射法
—Ca2+处理法
我国科学家独创
花粉管通道法
1.用___________将___________________直接注入____中；
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
2.在植物受粉后的一定时间内，剪去____，将________滴加在________上，使目的基因借助___________进入_____；
柱头
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
受体细胞：
受精卵
将目的基因导入受体细胞
大肠杆菌如何分泌人的胰岛素？
剪切
→ 拼接
→导入
→ 表达
将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
1.转化：
2.农杆菌特点：
①能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数___________没有侵染能力；
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
②农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
将目的基因导入受体细胞
剪切
→ 拼接
→导入
→ 表达
将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
植物组织培养
目的基因插入Ti质粒的T-DNA上
导入植物细胞
整合到 受体细胞的染色体DNA上
表达
转入 农杆菌
3.过程：
农杆菌转化法
3.过程：
构建基因表达载体
Ti质粒
目的基因
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入植物细胞染色体DNA中
植物细胞
植物组织培养
表现出新性状的植株
该过程经过__次拼接、__次导入
①第一次拼接
_______________________________
②第二次拼接
_______________________________
_______________________________
③第一次导入
__________________________________
④第二次导入
_______________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含重组Ti质粒【含有目的基因】的农杆菌导入受体细胞（非人工操作）
农杆菌转化法
3.过程：
4.转化的具体方法
——根据受体植物不同有所区别
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
将目的基因导入受体细胞
剪切
→ 拼接
→导入
→ 表达
将目的基因导入动物细胞
——显微注射法
2.受体细胞：
受精卵。
(因为受精卵容易表现出全能性)
3.过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
1.方法：
将目的基因导入受体细胞
大肠杆菌如何分泌人的胰岛素？
剪切
→ 拼接
→导入
→ 表达
将目的基因导入微生物细胞
2.受体细胞：
3.过程：
1.方法：
Ca2+处理
原核细胞（常选择大肠杆菌）
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
（原理？）
（原因？）
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。
Ca2+ 处理细胞
感受态细胞
表达载体与 感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
目的基因的检测和鉴定
大肠杆菌如何分泌人的胰岛素？
剪切
→ 拼接
→导入
→ 表达
按前面三个步骤进行了操作，
1.是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？
2.是否可以确定目的基因一定能够进行表达？
3.是否可以确定得到了新的性状？
不一定！
如何判断？
？
抗虫、抗病、分泌胰岛素等
目的基因的检测和鉴定
初次筛选：标记基因的筛选作用：
受体菌因不带有抗生素抗性基因，不能在含抗生素的培养基中生长。
【普通载体和表达载体】带有抗生素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌具有的抗性，能生长。
双标记基因
构建表达载体时在质粒的抗四环素基因上插入目的基因后：
表达载体中：抗四环素基因失活，只对氨苄青霉素有抗性。
普通载体中：对两种抗生素都有抗性。
1.用含氨苄青霉素的选择培养基筛选出导入 和 的受体菌。
2.用含四环素的选择培养基进一步筛选出导入 的受体菌。
普通载体
表达载体
表达载体
插入目的基因
步骤 结果和结论 1
2
双标记基因
不带有抗生素抗性基因的受体菌，不能在含抗生素的培养基中生长。
带有抗生素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌具有的抗性，能生长。
导入普通载体的受体菌：对两种抗生素都有抗性。能生长。
【4、5、7、8、10菌落】
导入表达载体的受体菌：对四环素没有抗性，不能生长。
【在上图A培养基上选取
1、2、3、6、9菌落】
目的基因的检测和鉴定课本P82
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
1.目的:
2.内容及方法:
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR扩增后电泳、
设计基因探针进行DNA分子杂交等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
原理：抗原-抗体的特异性结合
个体是否具有相应性状
比如抗虫、抗病、抗盐碱等
病原体接种实验等
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
一定浓度的盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的 原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；
DNA半保留复制
变性
90 C
延伸
72 C
复性
50 C
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着 的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
课本P84-85
负相关
负相关
电泳鉴定
课本P84-85
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
凝胶电泳原理示意图
移动快慢与DNA片段大小有关
DNA片段越大，移动越慢【负相关】
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
一次性
吸液枪头
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。(离心管)
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
课本P84-85
DNA片段的扩增
方法步骤
使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
——PCR技术
移液—
离心—
扩增
课本P84-85
PCR产物 DNA片段 电泳鉴定
方法步骤
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
1将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
3将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
2待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
配制
琼脂糖溶液
制备
琼脂糖凝胶
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于300nm紫外灯下观察和照相
加样
电泳
观察
课本P85
注意事项
PCR产物 DNA片段 电泳鉴定
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
课本P85
注意事项
PCR产物 DNA片段 电泳鉴定
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢 根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能请你查阅资料，了解以下问题。
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
课本P83
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢 根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能请你查阅资料，了解以下问题。
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
课本P83
转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢 根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能请你查阅资料，了解以下问题。
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
课本P83
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。
转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢 根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能请你查阅资料，了解以下问题。
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
课本P83
这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
课本P83 一、概念检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
(1)ap基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。
(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。
(3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。
×
×
√
2，利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 ( )
A . PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B .变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C .复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D .延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP 和4种核糖核苷酸
D
课本P83 二、拓展应用
1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
提示:外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插人。大多数情况下，插人的位点难以做到定点插人;插人的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
课本P83 二、拓展应用
2.八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtI基因转人水稻，使水稻胚乳中富含B-胡萝卜素。由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
(1)科学家在培育“黄金大米”时，将crtI和psy基因导人含pmi基因的质粒中，构建了质粒 pSYN12424。该项研究的目的基因是 ，标记基因是 ，质粒pSYN12424的作用是_______________________________。
crtI基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
课本P83 二、拓展应用
2.八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtI基因转人水稻，使水稻胚乳中富含B-胡萝卜素。由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
(2)在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列 为什么
提示:不能。
如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
课本P83 二、拓展应用
(3)请查找相关资料，了解科学家为什么要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广'黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
提示:维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻
中，使其胚乳中富含 β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食
就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。
关于“是否要推广'黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效
性等方面展开。在学生交流讨论的过程中，教师要注意引导他们
理性地表明观点和参与讨论。
基因工程操作程序小结
操作程序
目的基因的筛选和获取
基因表达载体的构建【核心】
将目的基因导入受体细胞【转化】
目的基因的检测与鉴定
筛选
PCR扩增
从基因文库获取
启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点
植物
动物
微生物
1.农杆菌转化法
2.花粉管通道法
方法：显微注射法
受体：受精卵
原因：具有全能性
特点：
方法：Ca2+处理法
感受态细胞
标记基因的筛选
1.PCR技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入目的基因。
2.PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA【电泳鉴定】
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原—抗体杂交技术；原理：是抗原—抗体的特异性结合
个体生物学水平上的鉴定
分子水平的检测：
抗虫
抗病
抗逆性
功能活性
基因工程小结
基因工程
理论基础
优点
工具
程序
应用
限制酶
DNA连接酶
载体
农牧业
医药卫生
食品
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
概念
原理
第二代基因工程
——蛋白质工程

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