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第6讲　基因工程的基本工具
新教材生物一轮复习
01
考点研析·重难突破

考点一　重组DNA技术的基本工具
1.基因工程的概念
2.基因工程的基本工具
（1）限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
（2）DNA连接酶——“分子缝合针”
（3）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。（选择性必修3 P71正文） （　×　）
2.限制酶在识别序列中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开形成的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。（选择性必修3 P71正文） （　√　）
3.基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶、载体。（选择性必修3 P71～72正文） （　×　）
4.质粒上标记基因的存在，是便于重组DNA分子的筛选。（选择性必修3 P72正文） （　√　）
×
√
×
√

1.（选择性必修3 P71旁栏思考）限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
2.（选择性必修3 P72旁栏思考）DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。
提示：不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个脱氧核苷酸。
1.基因工程的理论基础
2.与DNA有关的几种酶的比较

结合基因工程所需工具酶，考查科学思维
1.下表为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（　　）
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y为C或T，R为A或G。
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
解析：D　HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；由图可知，由于Y＝C或T，R＝A或G，因此HindⅡ能识别GTCGAC，也能识别GTTAAC，D错误。
2.第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因（如图甲）插入到适宜的质粒（如图乙）中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是（　　）
A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B.图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团
C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
解析：C　如果用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用BglⅡ和Sau3AⅠ切割质粒也形成这两种黏性末端，因此可构成重组DNA，A正确；质粒为环状DNA，只含有一个EcoRⅠ的切点，因此用EcoRⅠ切割后，该DNA分子变为线性双链DNA分子，因此含有2个游离的磷酸基团，B正确；从图甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后两端各有一个切口，与图乙中EcoRⅠ切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D正确。

限制酶的选择技巧
（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
结合载体的作用及特点，
考查科学思维能力
3.大肠杆菌的质粒——环状DNA是基因工程的常用载体，结构如图。下列叙述正确的是（　　）
A.①②③共同组成核糖核苷酸
B.质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则
C.DNA连接酶会使化学键④重新连接
D.若某种限制酶在质粒上只有一个限制酶切割位点，则质粒被切为两个片段
解析：B　①②③共同组成DNA的基本单位——脱氧核苷酸，A错误；质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则，A与T配对，G与C配对，B正确；DNA连接酶使DNA片段重新连接，该过程形成磷酸二酯键，图中的④不属于磷酸二酯键，C错误；限制酶识别特定序列并在特定位点切割，环状质粒上若只有一个限制酶切割位点，则质粒被切割为1个完整的DNA链状片段，D错误。
4.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（TetR）和氨苄青霉素抗性基因（AmpR）。请回答下列问题：
（1）EcoR Ⅴ酶切位点为 ，EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为 　　　　 末端。
解析：（1）从图中可以看出，EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。
答案：（1）平　
（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 　　　　 的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 　　　　 酶作用下，形成重组质粒P3。
解析：（2）从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。
答案：（2）胸腺嘧啶（T）　DNA连接　
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“＋”代表生长，“－”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是 　　　　 （填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 　　　　　　　　 、 　　　　　　　　　　 。
　　　　菌落类型 平板类型　　　　　 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
解析：（3）由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在无抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒，C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。
答案：（3）B　A类菌落含有P0　C类菌落未转入质粒　
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 　　　　 。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 　　　　　　　 。
解析：（4）据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，则无论目的基因是否插入正确，都能通过PCR扩增大量目的基因，如果用乙、丙作为引物，当目的基因插入不正确（反向插入）时，则乙、丙两引物都结合在外侧，PCR不能正常进行，因此选用乙、丙作为引物可以进行PCR鉴定。若扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。
答案：（4）乙、丙　目的基因反向连接
考点二　DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
2.实验步骤
提醒　①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸡血细胞作为材料。

1.DNA的粗提取实验中过滤能否用滤纸代替纱布？为什么？
提示：不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
2.实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
3.实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。

围绕DNA的粗提取与鉴定，考查实验
探究能力
1.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（　　）
A.向放有洋葱的研钵中加入适量研磨液研磨后会释放DNA
B.在含DNA的上清液中加入95%的冷酒精会出现白色丝状物
C.将丝状物加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是溶解DNA
D.将丝状物直接加入二苯胺试剂中，沸水浴冷却后会出现蓝色
解析：C　将丝状物加入2 mol/L的NaCl溶液中，DNA可以溶解在这个浓度的NaCl溶液中，而其他杂质不能溶解，从而达到去除杂质的目的，C错误。
2.如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，相关叙述错误的是（　　）
A.图1、2中溶液c、b分别是体积分数为95%的预冷酒精和2 mol/L的NaCl溶液
B.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C.图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质溶于酒精
D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
解析：D　图1表示在上清液中加入体积相等的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液，DNA析出，用玻璃棒搅拌卷起的丝状物就是粗提取的DNA，图2中溶液b是2 mol/L的NaCl溶液，作为鉴定DNA的对照组，A正确；图2所示实验的试管中，溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，C正确；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴条件下，物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺出现蓝色，D错误。
02
真题体验·感悟高考

从科学探究角度，考查DNA的粗提取
与鉴定
1.（2022·山东高考）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（　　）
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：B　低温时，DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；粗提取的DNA中可能含有RNA、脂质、少量蛋白质，D正确。
从科学思维角度，考查基因工程的
基本操作工具
2.（2021·湖北高考）限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割 双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（　　）
A.6 B.250
C.4 000 D.24 000
解析：C　据图可知，EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4
×1/4＝1/4 096，即4 096≈4 000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4 000，C符合题意。
3.（2021·全国乙卷）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
限制酶： EcoR Ⅰ　 Sma Ⅰ Pst Ⅰ　　 EcoR Ⅴ
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。如图中 　　　　　　　　　 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。如图中 　　　　　　　　　 酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
解析：（1）由题图可以看出，EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。
答案：（1）EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 　　　　　　　 。
解析：（2）DNA连接酶催化DNA链的5'端与另一DNA链的3'端生成磷酸二酯键。
答案：（2）磷酸二酯键　
（3）重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 　　　　 ；质粒DNA分子上有 　　　　　 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 　　　　　　 。
解析：（3）复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培养基上进行选择性培养可以将含质粒载体的细胞筛选出来。
答案：（3）复制　限制酶切割位点　选择性培养　
（4）表达载体含有启动子，启动子是指 　　　　　　　　　　　　　　　　 。
解析：（4）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
答案：（4）RNA聚合酶识别和结合的部位
4.（经典高考题）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
解析：（1）质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。
答案：（1）能自我复制、具有标记基因（答出两点即可）
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有 　　　　　　　　 （答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是 　　　　　 ；并且 　　 　　　　　　　　 和 　　　　　　　　 的细胞也是不能区分的，其原因是 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 　　　　　　　 的固体培养基。
解析：（2）在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。
答案：（2）二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于 　　　　　　　　 。
解析：（3）某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
答案：（3）受体细胞
03
课后作业·巩固提升

一、选择题
1.下列有关基因工程技术的叙述，错误的是（　　）
A.基因工程需要专门的工具，所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶
B.限制酶具有特异性，每种限制酶都能识别特定的核苷酸序列，切割后一定形成不同的黏性末端
C.目的基因进入受体细胞后不一定能成功实现表达，因此还需要进行检测和鉴定
D.基因工程能实现基因在不同种生物之间的转移，定向改造生物的遗传性状
解析：B　基因工程所用的工具酶是限制酶和DNA连接酶，A正确；限制酶具有特异性，每种限制酶都能识别特定的核苷酸序列，切割后形成黏性末端或平末端，B错误；目的基因进入受体细胞后不一定能成功实现表达，因此还需要从分子水平或个体水平进行检测和鉴定，C正确；基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外重组DNA和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，故基因工程能打破生殖隔离，实现基因在不同种生物之间的转移，定向改造生物的遗传性状，D正确。
2. 如图表示在适宜条件下，两个核酸片段经过X酶的催化作用形成一个 DNA分子片段的过程。下列叙述正确的是（　　）
A.X酶是DNA聚合酶
B.X酶可能是从大肠杆菌中分离得到的
C.X酶能催化氢键的形成
D.X酶能为磷酸二酯键的形成提供能量
解析：B　由图可知，该酶的作用是将两个DNA片段连接起来，故是DNA连接酶，A错误；DNA连接酶可能是从大肠杆菌细胞或其他生物中得到，B正确；DNA连接酶能催化磷酸二酯键的形成，C错误；酶不能提供能量，D错误。
3.限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使特定部位的磷酸二酯键断开。修饰酶能对DNA或RNA的碱基进行修饰，防止DNA或RNA被限制酶破坏。某些噬菌体能寄生在特定大肠杆菌体内进行繁殖。下列叙述正确的是（　　）
A.不能被噬菌体侵染的大肠杆菌，细胞膜上可能没有噬菌体可识别的特异性受体
B.能被噬菌体侵染的大肠杆菌，体内无核糖体，不能合成破坏外源DNA的限制酶
C.能寄生于大肠杆菌的噬菌体，其DNA上一定没有大肠杆菌限制酶的识别位点
D.能寄生于大肠杆菌的噬菌体，其DNA上不可能存在与大肠杆菌相同的修饰物
解析：A　不能被噬菌体侵染的大肠杆菌，细胞膜上可能没有噬菌体可识别的特异性受体，使得噬菌体不能对其识别并侵染，A正确；大肠杆菌为原核生物，体内含有核糖体，B错误；如果噬菌体的DNA上有修饰酶的识别位点，修饰酶能对DNA的碱基进行修饰，防止DNA被限制酶破坏，即使其DNA上有大肠杆菌限制酶的识别位点，其DNA也能在大肠杆菌内复制和表达，使得噬菌体能寄生于大肠杆菌，C错误；能寄生于大肠杆菌的噬菌体，DNA上可能也存在与大肠杆菌相同的修饰物，防止其被大肠杆菌内的限制酶识别并破坏，D错误。
4.如图是4种限制酶的识别序列及其酶切位点，下列叙述错误的是（　　）
A.不同类型限制酶切割后，有的产生黏性末端，有的产生平末端
B.不同类型的限制酶切割后可能产生相同的黏性末端
C.用酶1和酶2分别切割目的基因和质粒，连接形成重组DNA分子后，重组DNA分子不能被酶2识别
D.用酶3和酶4分别切割目的基因和质粒后，其产物经T4DNA连接酶催化能连接形成重组DNA分子
解析：C　结合图示可知，不同类型的限制酶切割后，有的产生黏性末端（酶1和酶2），有的产生平末端（酶3和酶4），A正确；不同类型的限制酶切割后可能产生相同的黏性末端，如图中的酶1和酶2，B正确；用酶1和酶2分别切割目的基因和质粒，形成的末端序列相同，连接形成重组DNA分子后，重组DNA分子仍能被酶2识别，C错误；用酶3和酶4分别切割目的基因和质粒后，产生的是平末端，而T4DNA连接酶能将平末端连接起来，即用酶3和酶4切割目的基因和质粒形成的产物经T4DNA连接酶催化可以连接形成重组DNA分子，D正确。
5.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点分别是 和 ，利用如图所示的质粒构建基因表达载体，仅考虑图中识别序列。下列叙述错误的是（　　）
A.用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割DNA后获得的黏性末端相同
B.若用限制酶Ⅱ切割质粒，则可得到两种DNA片段
C.若用限制酶Ⅰ切割目的基因，则有两个磷酸二酯键会被水解
D.构建基因表达载体时，应用限制酶Ⅱ切割质粒，用限制酶Ⅰ切割目的基因
解析：D　由题意可知，用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割DNA后获得的黏性末端相同，都是—GATC—，A正确；质粒上含有限制酶Ⅱ的两个酶切位点，若用限制酶Ⅱ切割质粒，两个标记基因都会被破坏，产生两种DNA片段，B正确；目的基因两端只含有限制酶Ⅰ的一个酶切位点，若用限制酶Ⅰ切割目的基因，则有两个磷酸二酯键会被水解，C正确；若用限制酶Ⅱ切割质粒，两个标记基因都会破坏，目的基因两端只含有限制酶Ⅰ的一个酶切位点，若用限制酶Ⅰ切割目的基因，不能获得目的基因，因此质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割，D错误。
6.如图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是（　　）
A.限制酶沿识别序列的中轴线两侧将DNA两条链切开
B.在图1和图2中将分别产生4个和2个黏性末端
C.限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D.图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
解析：C　由图可知，限制酶切割后产生的是黏性末端，可推知限制酶是在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开的，A正确；在图1和图2中将分别产生4个和2个黏性末端，B正确；限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键，不会切割氢键，C错误；图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶，D正确。
7.在DNA的粗提取实验中，下列有关实验材料选择的叙述，错误的是（　　）
A.选择DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大
B.选取动物材料时，最好选择哺乳动物成熟的红细胞
C.选取植物材料时，洋葱、豌豆、菠菜等较好
D.在液体培养液中培养的大肠杆菌也可作为实验材料
解析：B　选择DNA含量相对较高的生物组织，更容易提取到DNA，成功的可能性更大，A正确；哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和相关细胞器，细胞内没有DNA，不适合用于DNA的粗提取实验，B错误；选取植物材料时，避免选用没有细胞核的细胞，而洋葱、豌豆、菠菜等材料较好，含有大量的DNA，且容易取材，C正确；在液体培养液中培养的大肠杆菌也可作为实验材料，大肠杆菌是细菌，含有拟核和质粒，DNA含量也较多，适合提取DNA，D正确。
8.将外源基因导入受体细胞时通常利用质粒作为载体，下列关于质粒的说法，错误的是（　　）
A.质粒具有自我复制能力，存在于真核细胞细胞核或原核细胞拟核之外，化学本质是DNA
B.质粒具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中
C.真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
D.被用作载体的质粒，通常含有特殊的标记基因，如四环素基因、氨苄青霉素基因等
解析：D　质粒是具有自我复制能力，存在于真核细胞细胞核或原核细胞拟核之外的很小的环状双链DNA分子，A正确；质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA基因插入其中，B正确；天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，C正确；被用作载体的质粒，常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因或氨苄青霉素抗性基因等，D错误。
9.（不定项）用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内
切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切
位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述正确的是（　　）
A.图甲中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图乙中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图甲中被酶切的DNA片段是单链DNA
解析：ABC　图乙中①条带为SalⅠ酶切的结果，②条带为XhoⅠ酶切的结果，因此图甲中两种酶识别的核苷酸序列不同，A正确；图乙中酶切产物可用于构建重组DNA，B正确；限制酶SalⅠ有三处切割位点，切割后产生4个DNA片段，泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物，C正确；图甲中被酶切的DNA片段是双链DNA，D错误。
10.（不定项）番茄作为一种常见
的水果蔬菜，在日常生活中的需求
量日益增大，但是在较低温度下运
输或储存的过程中容易出现冻伤的
现象，从而影响番茄的口感和品质。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。如图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述正确的是（　　）
A.基因工程中用到的酶只有限制酶和DNA连接酶
B.获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间
C.应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免其自身环化或反向连接
D.能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因
解析：BC　基因工程中目的基因的扩增还需使用DNA聚合酶，A错误；为了保证目的基因正常表达，获得的目的基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，B正确；用限制酶SmaⅠ切割会破坏目的基因，因此构建基因表达载体时不能选用该酶，为了防止目的基因和质粒的自身环化或反向连接，应该用两种不同限制酶切割目的基因和载体，结合图示可知，应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒，C正确；能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中不都含有AFPs基因，也有可能是导入普通质粒的受体细胞，D错误。
二、非选择题
11. 目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图所示。
（1）构建人工质粒时要有标记基因，以便于 　　　　　　　　　　　　　　 。
解析：（1）质粒作为基因表达载体的条件之一是要有标记基因，以便于筛选（鉴别）目的基因是否导入受体细胞。
答案：（1）筛选（鉴别）目的基因是否导入受体细胞
（2）pBR322分子中有1个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G和A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端： 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。
解析：（2）同一种限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端为：
目的基因
—G　　　AATTC—……—G　　　AATTC—
—CTTAA　　　G—……—CTTAA　　　G—
答案： （2）如下所示：
目的基因
—G　　　AATTC—……—G　　　AATTC—
—CTTAA　　　G—……—CTTAA　　　G—
（3）pBR322分子中另有1个BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复 　　　　　　 键，成功获得了重组质粒，说明 　　　　　　　　　　　 。
解析：（3）DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的DNA片段，其末端相同。
答案： （3）磷酸二酯　两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的末端相同　
（4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无AmpR和TetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现为 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是 　　　　　　　　　　　　 。
解析：（4）由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamHⅠ作用后，标记基因TetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。
答案：（4）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素　pBR322质粒

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