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新人教版·选择性必修三
第3章 基因工程
第2节
基因工程的基本操作程序
（第1课时）
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。
抗虫棉新品种
100
多个
减少农药容量
40
万吨
增收节支社会效益
450
亿元
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤
目的基因的筛选与获取
目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
基因表达载体的构建
第1步：目的基因的筛选与获取
1. 目的基因
① 定义
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性
基因
生产药物
基因
毒物降解
基因
工业用酶
基因
苏云金杆菌
产生
Bt 基因
表达
伴胞晶体蛋白
(Bt抗虫蛋白)
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
杀死棉铃虫
导入
棉花细胞
培育
② Bt 基因
第1步：目的基因的筛选与获取
抗虫棉
非编码区
非编码区
编码区
启动子
终止子
RNA聚合酶的结合位点，转录起始的信号
编码蛋白质的合成
终止RNA的合成
第1步：目的基因的筛选与获取
③ 基因的结构
原核生物的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
启动子
终止子
外显子
内含子
第1步：目的基因的筛选与获取
③ 基因的结构
真核生物的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
转录
剪接
外显子
内含子
前体mRNA
成熟mRNA
第1步：目的基因的筛选与获取
③ 基因的结构
真核生物的基因结构
2. 筛选合适的目的基因
在浩瀚的“基因海洋”中找到所需要的目的基因往往不容易，从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
已知结构和功能清晰的基因
目的基因
第1步：目的基因的筛选与获取
① 明确目的基因
制成
杀虫剂
苏云金杆菌
防治棉花害虫
发现杀虫作用与Bt基因有关
掌握Bt基因的序列
深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)
掌握目的基因的功能
掌握目的基因的结构
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
第1步：目的基因的筛选与获取
① 明确目的基因
相关信息
第1步：目的基因的筛选与获取
① 明确目的基因
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只在某些昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
2. 筛选合适的目的基因
测序技术
测定核酸和蛋白质序列
序列数据库(如GenBank)
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
序列对比工具(如BLAST)
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能
明确了目的基因后，该怎么获得它呢？
第1步：目的基因的筛选与获取
② 筛选目的基因的技术手段
3. 利用PCR获取和扩增目的基因
我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的过程中，科学家人工合成了目的基因。
常用方法
DNA合成仪
PCR仪
第1步：目的基因的筛选与获取
① 人工合成法
② PCR扩增
3. 利用PCR获取和扩增目的基因
聚合酶链式反应的缩写
含义
根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
原理
第1步：目的基因的筛选与获取
② PCR扩增
DNA复制所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
目的基因DNA 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
缓冲液 维持反应体系的pH
Mg2+ 激活DNA聚合酶的活性
高温 打开DNA双链
第1步：目的基因的筛选与获取
引物
第1步：目的基因的筛选与获取
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。
（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）
引物
引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。
（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）
-3′
5′-
3′-
-5′
子链延伸
-5′
3′-
5′-
-3′
子链延伸
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程
4种脱氧核苷酸
引物
耐高温的DNA聚合酶
DNA模板
第① 步：变性
当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。
第1步：目的基因的筛选与获取
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程
第②步：复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
PCR的过程
第③步：延伸
当温度上升到72℃时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
3′
5′
5′
3′
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程
3′
5′
3′
5′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
第1轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程
3′
5′
3′
5′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
模板DNA
目的基因
3′
5′
5′
3′
引物1
引物2
原料
Taq聚合酶
50
72
95
℃
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
目的基因
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：高温变性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：高温变性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：高温变性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：低温复性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：中温延伸
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第二轮：高温变性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第二轮：高温变性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第二轮：低温复性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第二轮：中温延伸
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：高温变性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：高温变性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：低温复性
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：中温延伸
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程（三轮扩增）
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：中温延伸
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR的过程
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
DNA解旋为单链
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成。
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR扩增产物的鉴定
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
较小的DNA片段在凝胶中移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
600bp
700bp
800bp
1,200bp
1,000bp
900bp
标准
样品1
样品2
样品3
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（标准），这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
第1步：目的基因的筛选与获取
PCR扩增产物的鉴定
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
较小的DNA片段在凝胶中移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
600bp
700bp
800bp
1,200bp
1,000bp
900bp
标准
样品1
样品2
样品3
第1步：目的基因的筛选与获取
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 边解旋边复制 DNA在高温下变性解旋
全部解旋后在复制
场所 主要在细胞核内 细胞外（主要在PCR扩增仪内）
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ① 模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ② 原料：均为四种脱氧核苷酸 ③ 酶：均需DNA聚合酶 ④ 引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端合成子链 第1步：目的基因的筛选与获取
4. 通过构建基因文库获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
第1步：目的基因的筛选与获取
① 基因文库的定义
基因组文库
部分基因文库
第1步：目的基因的筛选与获取
② 基因组文库
基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。如果一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么，我们就可以说这个基因文库很大，就像国家图书馆，这种基因文库叫做基因组文库。
一种生物的一部分基因叫做部分基因文库
国家图书馆
（基因组文库）
部分基因文库
一种生物的全部基因叫做基因组文库。
第1步：目的基因的筛选与获取
③ 部分基因文库
一种生物的一部分基因叫做部分基因文库
国家图书馆
（基因组文库）
部分基因文库
一种生物的全部基因叫做基因组文库。
有一些基因文库比较小，就像某个市或某个单位的图书馆，只包含一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。如cDNA文库。
第1步：目的基因的筛选与获取
基因组文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
无
有
课程小结
基因工程基本操作程序
第1：目的基因的筛选与获取
第2：基因表达载体的构建
第3：将目的基因导入受体细胞
第4：目的基因的检测与鉴定
筛选合适的目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
通过构建基因文库获取目的基因

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