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新人教版·选择性必修三
第3章 基因工程
第2节
基因工程的基本操作程序
(第2课时）
质粒
1. 基因表达载体的作用
① 使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代。
② 使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用。
2. 基因表达载体的组成
复制原点
终止子
限制酶切割位点
启动子
标记基因
核心工作
第2步：基因表达载体的构建
2. 基因表达载体的组成
复制原点
终止子
限制酶切割位点
启动子
标记基因
质粒
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需地方停下来。
供目的基因插入载体中。
第2步：基因表达载体的构建
2. 基因表达载体的组成
复制原点
终止子
限制酶切割位点
启动子
标记基因
质粒
诱导性启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
第2步：基因表达载体的构建
2. 基因表达载体的组成
复制原点
终止子
限制酶切割位点
启动子
标记基因
质粒
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
便于重组DNA的筛选
第2步：基因表达载体的构建
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学 成分
位置
作用
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻碱基
mRNA上三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因首端
mRNA首端
mRNA首端
RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录出RNA
决定转录的结束
翻译的
起始信号
翻译的结束信号
第2步：基因表达载体的构建
启动子、终止子与起始密码子和终止密码子的比较
3. 基因表达载体的构建过程
质粒
限制酶
限制酶切割位点
首先，用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；
01
第2步：基因表达载体的构建
3. 基因表达载体的构建过程
然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
02
限制酶
限制酶切割位点
获取目的基因
目的基因
第2步：基因表达载体的构建
3. 基因表达载体的构建过程
利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
03
DNA
连接酶
重组
DNA分子
获取目的基因
第2步：基因表达载体的构建
3. 基因表达载体的构建过程
质粒
限制酶
限制酶
DNA
连接酶
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
重组
DNA分子
限制酶切割位点
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
第2步：基因表达载体的构建
4. “单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体
单酶切
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
a、b、c、d四个黏性末端相同
第2步：基因表达载体的构建
单酶切有什么缺点
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
缺点1：
在DNA连接酶的作用下，质粒被重新环化。
DNA连接酶
连接
第2步：基因表达载体的构建
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
缺点2：
在DNA连接酶的作用下，目的基因被环化。
DNA连接酶
连接
第2步：基因表达载体的构建
单酶切有什么缺点
缺点3：
在DNA连接酶的作用下，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
反向连接
重组DNA
a
d
c
a
第2步：基因表达载体的构建
单酶切有什么缺点
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
反向连接
重组DNA
a
d
c
a
缺点1
缺点2
缺点3
质粒重新环化
目的基因
被环化
第2步：基因表达载体的构建
单酶切有什么缺点
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
限制酶a切割
a
b
DNA连接酶
连接
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
a
b
第2步：基因表达载体的构建
双酶切
基因表达载体
导入
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
第3步：将目的基因导入受体细胞
构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。
方法1：花粉管通道法
我国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞。
子房注射
用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
第3步：将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入植物细胞
花粉管通道法
花柱滴加
外源DNA进入受精卵，并进行随机整合。
第3步：将目的基因导入受体细胞
花柱滴加
花粉落到柱头上，刺激花粉管萌发并生长至子房
01
剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管进入囊胚。
02
优点
第3步：将目的基因导入受体细胞
花柱滴加
① 利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
② 操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。
萌发的花粉管
柱头
花柱
子房
胚囊
卵细胞
转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
① 农杆菌
是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
第3步：将目的基因导入受体细胞
方法2：农杆菌转化法
① 农杆菌
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到细胞的染色体上。
第3步：将目的基因导入受体细胞
农杆菌
Ti质粒
T-DNA
目的基因插入Ti质粒的T-DNA中形成重组Ti质粒
第3步：将目的基因导入受体细胞
②农杆菌转化法的原理
转化植物细胞
重组Ti质粒转入农杆菌
目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上
目的基因在植物细胞中稳定存在并表达
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入植物细胞
含重组Ti质粒的农杆菌
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
表现出新性状的植物
目的基因
Ti质粒
第3步：将目的基因导入受体细胞
②农杆菌转化法的原理
① 两次拼接
第一次拼接：
目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
第二次拼接：
被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
第3步：将目的基因导入受体细胞
②农杆菌转化法的原理
第1次
拼接
第2次
拼接
② 两次导入
第一次导入：
将目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌
第二次拼接：
含目的基因的T-DNA导入受体细胞
第3步：将目的基因导入受体细胞
②农杆菌转化法的原理
第1次
导入
第2次
导入
将目的基因导入动物细胞
① 导入动物细胞通常选择受精卵。
② 导入方法：显微注射法
受精卵
注射器
固定吸管
第3步：将目的基因导入受体细胞
繁殖快
单细胞
遗传物质少
① 原核生物作为受体细胞的优点
② 导入方法（感受态细胞法）
Ca2+处理大肠杆菌细胞
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态
将重组的基因表达载体导入
第3步：将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入原核细胞
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
提取棉花细胞的DNA
通过PCR等技术检测
第4步：目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
① 检测目的基因是否导入
用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
如：检测Bt基因是否转录出mRNA
提取棉花细胞mRNA
通过PCR等技术检测
第4步：目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
② 检测目的基因是否翻译出mRNA
逆转录产生DNA
用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
如：检测Bt基因是否翻译出Bt抗虫蛋白
用于抗原-抗体杂交检测
第4步：目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
③ 检测目的基因是否翻译
从棉花中提取蛋白质
用相应抗体进行抗原-抗体杂交检测
第4步：目的基因的检测与鉴定
2. 个体水平的检测
检测目的基因是否表现出相应的性状
如：检测抗虫棉是否具有抗虫性状
采摘抗虫棉叶片
饲喂棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
获取质粒
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
基因工程的基本操作流程图
1. 利用PCR获取和扩增目的基因
2. 人工合成目的基因
3. 通过构建基因文库获取目的基因
获取质粒
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
3. 用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段
4. 用DNA连接酶连接
基因工程的基本操作流程图
获取质粒
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
5. 导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法
导入动物细胞：显微注射法
导入原核细胞：感受态细胞法
基因工程的基本操作流程图
获取质粒
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
6. 分子水平上的检测
① 检测目的基因是否导入（PCR等技术检测）
② 检测目的基因是否转录（ PCR等技术检测）
③ 检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测）
7. 个体水平检测
基因工程的基本操作流程图
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ）
构建afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶 （ ）
只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功 （ ）
练习与应用
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
练习与应用
D
研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传时很复杂的、例如，科研人员在对转GUS基因（β-葡糖醛酸糖苷酶基因）的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排也都可以影响外源基因的稳定性。
练习与应用

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