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选择性必修三 第2章 基因工程的基本操作程序
一、你从教材上找到的关键性语句：
（一）目的基因的筛选与获取
1.目的基因概念
在基因工程的设计和操作中，用于__改变受体细胞性状__或__获得预期表达产物_等的基因就是目的基因（根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__编码蛋白质的基因___）。
2.筛选目的基因的方法
（1）从相关的__已知结构__和__功能清晰__的基因中进行筛选。
（2）获取方法
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR的概：PCR是__聚合酶链式反应__的缩写，是一项根据_DNA半保留复制_的原理，在_体外_提供参与DNA复制的__各种组分__与_反应条件_，对_目的基因的核苷酸序列_进行__大量复制__的技术。
①全称：__聚合酶链式反应___
②原理：___DNA半保留复制___
③操作环境：__体外（PCR扩增仪/PCR仪）___
④目的：__对目的基因的核苷酸序列进行大量复制___
⑤优点：___可以在短时间内大量扩增目的基因___
（2）DNA体内复制的条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
解旋酶 打开DNA双链
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
注：引物是一小段能与_DNA母链__的一段碱基序列__互补配对_的_短单链核酸__。
（3）DNA体外复制（PCR）的条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
90℃以上高温 打开DNA双链（变性温度）
耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链
缓冲液（含Mg2+ ) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
其他不同的温度 变性、复性和延伸 需要不同温度
（4）过程
目的基因DNA__受热变性__后_解为单链_，_引物 与单链相应_互补序列_结合；然后以__单链DNA__为模板在_DNA聚合酶_作用下进行_延伸__，即将4种_脱氧核苷酸__加到__引物的3’__，如此__重复循环多次__， 每次循环一般可以分为_变性、复性和延伸_三步。
变性 温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
4.获取目的基因的其他方法
（1）构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
①基因组文库：包含一种生物所有的基因。
②部分基因文库：只包含一种生物一部分基因，如cDNA文库。
（2）利用化学方法人工合成：用DNA合成仪，要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知，不需要模板。
（二）基因表达载体的构建（核心）
1.基因表达载体的组成
基因表达载体必须包括_目的基因_、__标记基因_、_启动子_、_终止子_等（若需要能完成自主复制，还应有_复制原点_）。
（1）启动子
①本质：一段有特殊序列结构的_DNA_片段。
②位置：位于基因的_上游_，紧挨__转录的起始位点__。
③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA___。
④特殊类型：_诱导型启动子___。
⑤诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达__。
（2）终止子
①本质：一段有特殊序列结构的_DNA__片段。
②位置：位于基因的_下游_。
③功能：使转录在所需要的地方停下来__。
（3）标记基因
①作用：_便于重组DNA分子的筛选_
②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等
（4）基因表达载体的构建过程
一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。
（三）将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞—花粉管通道法
（1）操作方式
①用__微量注射器_将__含目的基因的DNA溶液_直接注入_子房_中。
②在_植物受粉后_的一定时间内，_剪去柱头_，将__DNA溶液___滴加在_花粉管通道__上，使目的基因借助_花柱切面__进入_胚囊_。
（2）受体细胞：_受精卵__。
2.将目的基因导入植物细胞—农杆菌转化法
（1）转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程__。
注：此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是、、、、。
（2）农杆菌特点：
①能在自然条件下侵染__双子叶植物_和_裸子植物__，而对大多数__单子叶植物_没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有__Ti质粒_，当它侵染植物细胞后，能将_Ti质粒_上的_T-DNA_（ 可转移的DNA ）转移_到被侵染的细胞，并且将其__整合到该细胞的染色体DNA上__。
（3）农杆菌转化法的过程：将目的基因插入_Ti质粒的T-DNA__中，通过农杆菌的_转化_作用，就可以使目的基因_进入植物细胞_，并___整合到受体细胞的染色体DNA上__，使目的基因能够_维持稳定和表达__。
3.将目的基因导入动物细胞—显微注射法
（1）受体细胞：_受精卵_
（2）过程：
4.将目的基因导入微生物细胞—Ca2+处理法
（1）受体细胞：常用__原核生物__作为受体细胞，其中以__大肠杆菌_最广泛
（2）原核生物的优点：_繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养__
（3）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程：
（四）目的基因的检测与鉴定
检测目的 检测方法 判断标准
目的基因是否插入转基因生物的DNA DNA分子杂交技术 是否出现杂交带
目的基因是否转录出了mRNA 分子杂交技术 是否出现杂交带
目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交技术 是否出现杂交带
个体水平的检测 如抗虫、抗病的接种实验 是否表现出相应的特性
（五）DNA片段的电泳鉴定
（1）实验原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反 的电极移动。
（2）影响DNA分子的迁移率的因素：DNA的分子大小，DNA分子的构象，凝胶的浓度。
（3）电泳出现位置不等的几条条带，说明存在长短不一的DNA片段，鉴定的PCR产物不纯净。
二、判断训练：
目的基因的获取的方法通常的两种：目的基因的序列未知的，可以用化学方法合成目的基因，如胰岛素基因，或者用PCR技术扩增目的基因；目的基因的序列已知的，可以先建立基因文库，然后从中找到需要的目的基因 (　　)
在形成重组DNA分子时，通常用相同的限制酶切割目的基因和载体DNA (　　)
用质粒作为载体，宿主细胞应该选择大肠杆菌，要用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞膜的通透性 (　　)
将目的基因导入植物细胞，最常用的方法是农杆菌转化法，此方法的受体细胞大多是体细胞(　　)
将目的基因导入动物细胞，最常用的方法是显微注射技术，此方法的受体细胞大多是体细胞(　　)
转基因植物与转基因动物体内的目的基因通常是不遵循孟德尔定律的(　　)
筛选含目的基因的受体细胞的通常依据是受体细胞是否具有载体特有的“标记基因”所控制的性状，常用的标记基因是抗性基因(　　)
通常用抗原－抗体特异性反应的方法，检测多细胞生物中目的基因是否表达；单细胞生物中目的基因是否表达，常检测相应性状是否出现(　　)
转入人的胰岛素原基因的大肠杆菌，可通过检测大肠杆菌是否产生胰岛素，来判断目的基因是否表达 (　　)
基因工程的受体细胞主要有：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、植物细胞和动物细胞(　　)
利用显微注射的方法将目的基因直接导入受体细胞，而不需要DNA载体。(　　)
用同种生物的不同细胞构建的cDNA文库都是相同的。(　　)
如果要将人生长激素基因导入大肠杆菌，应从cDNA文库中获取目的基因，或用人工化学合成的方法获取。(　　)
用限制性内切酶切割得到的人胰岛素原基因，导入大肠杆菌细胞后不能得到有效的表达。(　　)
成功导入外源基因就标志着基因工程的成功。(　　)
检测受体细胞是否导入了目的基因，以及受体细胞中导入的目的基因是否转录出mRNA，可用相同的目的基因探针进行诊断。(　　)
为检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成胰岛素原，常用抗原-抗体杂交技术。(　　)
载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达(　　)
利用基因工程技术使大肠杆菌合成人的蛋白质的过程中常用同种的限制性内切酶处理目的基因和质粒(　　)
基因工程的四个操作步骤中都需要遵循碱基互补配对的原则(　　)
启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录过程中起作用。(　　)
检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。(　　)
转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定要通过分子检测才能达到目的。(　　)
目的基因导入双子叶植物必须用花粉管通道法。(　　)
外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。( )
用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。( )
用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。( )
目的基因导入双子叶植物也常采用农杆菌转化法。( )
为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞。( )
转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定是通过PCR等技术来检测。( )
检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。( )
一个表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等。( )
只要目的基因进入受体细胞就能实现表达。( )
PCR扩增中加热到50 ℃左右的目的是在Taq DNA聚合酶作用下合成子链。( )
复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物。( )
凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。( )
电泳时，应有一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。( )
生物体内DNA分子的解旋一定需要解旋酶，在体外则只需要高温。(　　)
耐高温的DNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中必须加入的物质之一。(　　)
三、边练边讲
练习1：基因工程的基本操作程序
1、如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　)
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
2、某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是(　　)
A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
3、第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因插入适宜的质粒中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体产生免疫反应，且可持续一段时间。下列有关DNA疫苗的叙述，正确的是(　　)
A．DNA疫苗的表达产物不是抗原
B．DNA疫苗生产过程不需要解旋酶和限制酶
C．抗原基因在体内表达时不需要RNA聚合酶
D．DNA疫苗的特异性与碱基种类无关
4、科研人员先分别PCR扩增尿酸酶基因和原核生物胞外蛋白信号肽基因(编码的肽链能引导新合成的蛋白质转移、分泌)，再将它们拼接形成融合基因，并导入大肠杆菌生产尿酸酶。下列相关叙述错误的是(　　)
A．扩增两类基因时可以通过设计引物来控制两类基因的拼接方向
B．构建融合基因的目的是使大肠杆菌能合成尿酸酶并分泌到细胞外
C．融合基因导入大肠杆菌前需构建基因表达载体，以保证目的基因正常表达和遗传
D．在导入融合基因前，应先用NaCl溶液处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
5、为了增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与转运肽基因相连，一起导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。
(1)研究人员采用________技术快速扩增从陆地棉基因文库中获取的酶D基因和从拟南芥基因文库中获取的转运肽基因。所含三种限制酶(ClaⅠ、SacⅠ、XbaⅠ)的切点如图所示，则用____________酶处理两个基因后，可得到________(填图中字母)端相连的融合基因。
(2)将上述融合基因插入如图所示Ti质粒的T－DNA中，构建____________并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含________的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落，再利用液体培养基振荡培养，可以得到用于转化的侵染液。
(3)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是_____ _________________________，进一步筛选后获得转基因油菜细胞，该细胞通过____________技术，可培育成转基因油菜植株。
(4)用______________法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否表达。
讲解1：基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
1、利用PCR技术扩增目的基因：
2、从构建的____________中获取目的基因。
3、通过____________的方法获得目的基因。
二、基因表达载体的构建
1．基因工程表达载体的理解
2．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
比较项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA上三个相邻的碱基
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸）
3．构建基因表达载体时限制酶的选择(以下图为例)
(1)根据目的基因两端的限制酶切点以及是否破坏目的基因来确定限制酶的种类：
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和目的基因与质粒的反向连接，可使用两种切割后能产生不同末端的限制酶切割目的基因所在片段和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类：
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保切割后能产生相同的末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以要考虑所选择的限制酶对这些标记基因等是否有破坏作用，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选限制酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
三、将目的基因导入受体细胞
1．不同受体细胞的常用导入方法
项目 植物细胞 动物细胞 大肠杆菌等微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 大肠杆菌等
转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→目的基因表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→胚胎移植→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→表达载体与Ca2＋处理过的细胞混合→受体细胞吸收DNA分子，完成转化过程
2．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
(1)拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(2)导入：
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
3．植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，但受精卵全能性高，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。
四、目的基因的检测与鉴定
1．目的基因检测与鉴定的“两个水平”
2．常见不同转基因生物在个体生物学水平上的鉴定方法：个体水平的鉴定实际上是检测目的基因是否表达出所控制的性状。
转基因生物 鉴定方法 观察目标
抗虫植物 害虫吞食 害虫是否死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 是否未出现病斑
抗盐植物 盐水浇灌 是否正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 是否正常生长
获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能活性是否正常
练习2：PCR技术和DNA片段的电泳鉴定
1、利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n代，正确的是(　　)(多选)
A．测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对
B．要求引物的序列是互补的
C．2n对引物参与子代DNA分子的合成
D．向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等
E．保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行
2．下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定原理的说法，错误的是(　　)(多选)
A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B．DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、构象和凝胶的浓度有关
C．凝胶中的DNA分子经染色后可在波长为300 nm的紫外灯下检测
D．PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA
E．PCR中引物的作用是使DNA连接酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
F．电泳的原理是在电场的作用下，带电的DNA分子会向着与它所带电荷相反的电极移动
3．在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。下列相关叙述不正确的是(　　)
A．该载体最可能为环形DNA分子
B．两种限制酶在载体上识别的序列不同
C．限制酶R1与R2的酶切位点最短相距约200 bp
D．限制酶切割时会导致作用位点的氢键和肽键断裂
4．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
讲解2：PCR技术和DNA片段的电泳鉴定
1．PCR技术和DNA复制的比较
⑴复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合，因此一般在PCR实验中引物的投入量远大于产物量。
⑵一次PCR一般要经历30次循环。
二、PCR技术和电泳鉴定
1．实验原理
(1)DNA片段的扩增：
①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。
②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)DNA片段的电泳鉴定：
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基因可以带上正电荷或负电荷。
②迁移动力与方向：在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2．相关计算
⑴第____代出现完整的目的基因
⑵n代后，含引物的DNA分子有_2n__个
⑶n代后，共消耗_2n+1-2_个引物
⑷第n代复制，消耗了_2n_个引物
⑸n代后，完整的目的基因有_2n-2n_个

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