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选择性必修三 第3章 重组DNA技术的基本工具
一、你从教材上找到的关键性语句：
（一）、基因工程的概念
1. 基因工程的概念
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
操作原理 基因重组
操作结果 按照人类的需要定向改造生物的遗传特性
2．基因重组的类型
（1）真核生物有性生殖过程中，减数分裂时发生的基因重组：①交换型；②自由组合型。
（2）肺炎链球菌的转化实验中发生的基因重组。
（3）基因工程中人工操作导致的基因重组。
3．几乎所有生物的DNA分子都是由4种脱氧核苷酸形成的规则的双螺旋结构。
4．所有生物都共用一套遗传密码。
5．目的基因可在受体细胞内独立表达的原因是基因是控制生物性状的结构和功能单位，具有相对独立性。
（二）、分子手术刀—限制性内切核酸酶
1.全称和简称
全称：_限制性内切核酸酶_
简称：__限制酶_
2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的
3.作用：
①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列 。
②使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。
4.作用部位：_磷酸二酯键__
5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。
（1）EcoRⅠ限制酶切割
EcoRⅠ识别序列为GAATTC
EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键
（2）SmaⅠ限制酶切割
SmaⅠ识别序列为CCCGGG
SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键
（三）、分子缝合针—DNA连接酶
1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。
2.分类和对比
种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只缝合 黏性 末端 缝合 黏性 末端 平 末端
作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
（四）、分子运输车——载体
1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。
2．常用载体——质粒
（1）本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
（2）质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
（3）作用
①作为运输工具，将外源基因导入细胞。
②质粒携带外源基因在细胞内大量复制。
（五）探究.实践：DNA的粗提取与鉴定
1.提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在酒酒酒酒酒酒性质方面存在的差异，选用适当的物理或化学方法对他们进行提取。
2.提取原理：
①DNA不溶于酒精 ，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质；
②DNA在不同浓度的NaCl溶液 中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.鉴定原理：在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂 会呈现蓝色，因此二苯胺试剂 可以作为鉴定DNA的试剂。
4.比较DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
溶解规律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液
DNA 溶解 析出
5．DNA粗提取中的注意事项
（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞 无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
（2）加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精 和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀 。
（3）二苯胺试剂要现配现用 ，否则会影响鉴定的效果。
（4）提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜 ，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
（5）在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精 的作用是溶解杂质和析出DNA。
二、判断训练：
一种生物的基因能“嫁接”到另一种生物的DNA上，是因为生物界的主要遗传物质是DNA，且它们有共同的结构基础(　　)
外源（目的）基因在受体细胞内得以表达的主要原因是生物界共用一套遗传密码(　　)
基因工程育种的突出优点是能定向改造生物的性状，目的性强(　　)
因为DNA连接酶对所催化连接的DNA分子片段的碱基序列无特异性要求，所以其无专一性 (　　)
解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、限制性内切酶都能作用于DNA分子，它们的作用部位都是相同的。(　　)
用相同的限制性内切酶切割DNA留下的黏性末端是一定相同的；用不同的限制性内切酶切割DNA留下的黏性末端一定是不相同的。(　　)
DNA连接酶与DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键的形成，但前者只催化游离脱氧核苷酸连接到已有脱氧核苷酸链上，后者催化两个DNA片段的连接。(　　)
质粒作为“分子运输车”的条件是①能够自我复制　②双链环状DNA分子③有多个限制酶切点④有标记基因　⑤真核细胞中没有(　　)
限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。(　　)
不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的末端相同。(　　)
所有DNA连接酶都既能连接黏性末端，又能连接平末端。(　　)
载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。(　　)
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度相同。(　　)
限制酶只能用于切割目的基因。( )
切割目的基因的限制酶可以是两种。( )
限制酶也可以识别和切割RNA。( )
限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。( )
载体质粒的抗生素合成基因常作为标记基因。( )
载体质粒的标记基因可以有一个或多个。( )
载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。( )
用95%的冷酒精粗提取DNA是因为95%的冷酒精使DNA变性。( )
用二苯胺试剂鉴定DNA时，溶液蓝色深浅反映DNA含量多少。( )
用二苯胺试剂进行鉴定，原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色。( )
三、边练边讲
练习1：重组DNA技术的基本工具
1．如图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，下列选项中，表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用图解的正确顺序是(　　)
A．①②③④　 B．②①④③ C．①④②③ D．①④③②
2．如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析以下说法正确的是(　　)
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ HindⅡ KpnⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
注：Y表示C或T，R表示A或G。
A．一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
B．限制酶的切割位点一定位于识别序列的内部
C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端
D．限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端
3．下列有关基因工程的工具的叙述，正确的是(　　)
A．基因工程的载体都是质粒
B．限制酶和其他酶一样具有专一性，只能识别特定的核苷酸序列
C．噬菌体可以作为动物基因工程的载体
D．天然质粒均可以直接用作载体将目的基因导入受体细胞
4．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(　　)
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
5．一环状DNA分子，设其长度为1，限制酶A在其上的切点位于0.0处；限制酶B在其上的切点位于0.3处；限制酶C的切点未知，但C单独切割或与A或与B同时切割的结果如表所示，C在该环状DNA分子上的切点应位于图中的(　　)
A．0.2和0.4处　　B．0.4和0.6处 C．0.5和0.7处 D．0.6和0.9处
6．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_______________， ___________________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是____________________；并且____
________和_______________的细胞也是不能区分的，其原因是________________
__________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________。
讲解1：重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的原理：基因重组
2．基因工程的理论基础
(1)拼接的基础：
①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。
②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。
③碱基配对方式相同：与T配对、G与C配对。
(2)导入的基础：DNA可以在同种生物的不同个体间转移。
(3)表达的基础：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。
3．基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？
有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行；基因工程可以在不同物种间进行基因重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
4．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因原则：载体必须具备标记基因，所以选择的限制酶不能将标记基因全部破坏，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同末端原则：切割载体时通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如选择PstⅠ；为避免目的基因和载体自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和载体，即可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(4)为了避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，目的基因和质粒均可使用不同限制酶切割。
5．比较与DNA有关的六种酶
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
6．目的基因的载体
⑴标记基因的作用：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以筛选出转入载体并稳定表达的受体细胞，原理如图所示。
说明：目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
⑵质粒中的每个标记基因都一定要避免被限制酶切割吗？否
⑶病毒为什么可以作为基因工程的载体？
因病毒能够侵染正常细胞，有的病毒还能将自己的核酸整合到宿主细胞的染色体上，所以病毒也可作为基因工程的载体。
⑷为什么在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的？
天然质粒往往不能满足载体必须具备的条件，如无可利用的标记基因、无特定限制酶的识别序列等。
⑸基因工程中的载体≠细胞膜上的载体
练习2：DNA的粗提取与鉴定
1、DNA粗提取过程中利用的溶液为(　　)
A．体积分数为95%的冷酒精 B．体积分数为75%的冷酒精
C．2 mol/L的NaCl溶液 D．0.14 mol/L的NaCl溶液
2、下列关于DNA粗提取与鉴定实验的有关叙述中，不正确的是(　　)
A．在析出DNA黏稠物时，应用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子的完整性
B．将猪的成熟红细胞破碎后离心，取上清液，加入冷酒精再搅拌后，应再保留上清液
C．在提取液中加入体积分数为95%的冷酒精后DNA会与蛋白质分离并析出
D．提取的丝状物溶解后加入二苯胺溶液，水浴加热后溶液变为蓝色
3、DNA的粗提取与鉴定”实验中，A、B、C三个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均相同，而且正确，但实验结果却不同。
组别 实验材料 提取核物质时加入的溶液 去除杂质时加入的溶液 DNA鉴定时加入的试剂
A 菜花 蒸馏水 95%的酒精(冷却) 双缩脲
B 人血浆 蒸馏水 95%的酒精(冷却) 二苯胺
C 鸡血 蒸馏水 95%的酒精(冷却) 二苯胺
(1) 实验材料选择错误的组别是 ，其原因是 。
(2)实验中DNA鉴定试剂选择错误的组别是 。
(3) 沸水浴中试管颜色变蓝的组别是 。
(4) A组实验不成功的最主要原因是 。
讲解2：DNA的粗提取与鉴定
1．实验设计
(1)实验材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织。不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。
(2)DNA的粗提取：可利用DNA不溶于____________这一原理，可从溶液中析出DNA；也可将溶液在10 000 r/min的转速下离心5 min，___________即为粗提取的DNA。
2.提取和鉴定中的问题分析
(1)加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。
(2)为减少DNA的损失：
①过滤过程一般使用纱布过滤
②因DNA容易被玻璃容器吸附，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管。
(3)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质等。
(4)析出DNA时必须用“冷酒精”。预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
(5)实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏DNA。
(6)二苯胺试剂要现用现配，鉴定时，需沸水浴加热，溶液蓝色的深浅与溶液中DNA含量的多少有关。
3．提取纯度较高的DNA的方法——苯酚—氯仿抽提法
(1)苯酚—氯仿抽提法原理
苯酚是蛋白质的变性剂，反复抽提可使蛋白质变性，SDS(十二烷基硫酸钠)将细胞裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽等，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利进入水溶液，形成稳定的胶体溶液。当有机溶剂存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则位于两相之间。
(2)主要试剂的作用
苯酚—氯仿抽取的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的苯酚。
(3)溶解DNA备用
用2～3倍体积的体积分数为95%的乙醇在NaCl溶液作用下处理抽提后的DNA溶液，沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇洗去DNA沉淀中的NaCl，回收DNA，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

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