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第36讲
基因工程和生物技术的
安全性与伦理问题
第二课时
2
1
3
重组DNA技术的基本工具
基因工程的基本操作程序
考点梳理
基因工程的应用和蛋白质工程
知识梳理
DNA的复制相关计算
神经调节和体液调节的关系
4
生物技术的安全性与伦理问题
基因工程的基本操作程序
考点2
1. 目的基因：用于改变受体细胞性状或 获得预期表达产物 等的基因，
主要是指 编码蛋白质的基因。P313
2. 基因工程的基本操作程序
其包括：目的基因的筛选与获取、
基因表达载体的构建、
将目的基因导入受体细胞、
目的基因的检测与鉴定。
3. 第一步：目的基因的筛选与获取
（1）筛选合适的目的基因：从相关的 已知结构 和 功能清晰 的基因中进行筛选。
① 目的基因的核苷酸序列未知：从基因文库中寻找
② 目的基因的核苷酸序列已知
a. 人工合成法：基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
b. 聚合酶链式反应（PCR）扩增
（2）利用PCR获取和扩增目的基因。
① PCR：聚合酶链式反应。
② 原理：DNA半保留复制。
③ 反应场所：PCR扩增仪
3. 第一步：目的基因的筛选与获取
（2）利用PCR获取和扩增目的基因。
④ 条件 在DNA复制中的作用
高温 打开DNA双链
模板：目的基因所在的DNA片段 提供DNA复制的模板
原料：4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
酶：耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物：2种 分别于单链相应序列相结合，使DNA聚合酶
能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
缓冲液 维持反应体系pH稳定
控制温度 使DNA复制在体外反复进行
引物是一小段能与DNA母链的一段
碱基序列互补配对的短单链核酸
（含Mg2+)
激活真核
细胞和细菌的
DNA聚合酶
3. 第一步：目的基因的筛选与获取
（2）利用PCR获取和扩增目的基因。
⑤过程 说明 图解
变性 当温度上升到90 ℃以上时， 双链DNA解聚为单链
复性 当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通 过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 当温度上升到72 ℃左右时， 耐高温的DNA聚合酶有最大活性， 可使DNA新链由5′端向3′端延伸
⑥ 结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，
随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。
3. 第一步：目的基因的筛选与获取
（2）利用PCR获取和扩增目的基因。
注意：
a. 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），
既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
b. 引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。
细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
c. 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。
因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
1. 目的基因：用于改变受体细胞性状或 获得预期表达产物 等的基因，
主要是指 编码蛋白质的基因。P313
2. 基因工程的基本操作程序
其包括：目的基因的筛选与获取、
基因表达载体的构建、
将目的基因导入受体细胞、
目的基因的检测与鉴定。
目的基因DNA __________ 后 ___________，_____ 与单链相应互补序列结合；
然后以 __________ 为模板在 ___________________ 作用下进行 _____，即将4种 ____________ 加到 _____________，如此重复循环多次。
每次循环一般可以分为 _______、_______、_______三步。
由于延伸后得到的 _____ 又可以作为下一个循环的 _____，因而每一次循环
后目的基因的量可以增加 _____，即成 _____ 形式扩增（约为2n，其中n为扩增
循环的次数）。
过程归纳：
受热变性
解聚为单链
引物
延伸
单链DNA
耐高温DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
产物
模板
一倍
指数
变性
复性
延伸
细胞内DNA复制与PCR技术的区别
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
不同点 场所 细胞内（主要是细胞核中） 体外（PCR扩增仪中）
解旋 在解旋酶的作用下边解旋边复制 90～95 ℃高温解旋，
双链完全分开
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶
温度 体内温和条件 在较高温度下进行，
需控制温度
相同点 ①提供DNA模板；②四种脱氧核苷酸为原料
4. 第二步：基因表达载体的构建——基因工程的核心
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，
使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的构建。
a. 目的基因
b. 启动子
c. 终止子
d. 标记基因
e. 复制原点
4. 第二步：基因表达载体的构建——基因工程的核心
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，
使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的构建。
a. 目的基因
b. 启动子
c. 终止子
d. 标记基因
e. 复制原点
位于基因的下游，也是一段特殊序列结构的DNA片段，使转录终止。
是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，
紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，
有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
DNA复制的起始位点（能自主完成复制）
便于重组DNA的筛选
4. 第二步：基因表达载体的构建——基因工程的核心
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，
使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的构建。
若考虑两两相连，
则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：
目的基因与目的基因连接，
目的基因与质粒的连接，
质粒与质粒的连接，
需筛选出重组质粒
4. 第二步：基因表达载体的构建——基因工程的核心
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，
使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的构建。
（3）
启动子≠起始密码子　终止子≠终止密码子
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录过程
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
基因结构——原核细胞
非编码区
非编码区
编码区（转录）
启动子
终止子
RNA聚合酶结合位点
转录
mRNA
起始密码子
终止密码子
基因结构——真核细胞
非编码区
非编码区
编码区（转录）
启动子
终止子
RNA聚合酶结合位点
转录
前体mRNA
内含子
外显子
加工
成熟mRNA
起始密码子
终止密码子
5. 第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）转化：目的基因进入受体细胞内，
并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（2）常用方法：
将目的基因导入植物细胞
① 花粉管通道法：我国科学家独创的方法
② 农杆菌转化法
将目的基因导入动物细胞：显微注射法
将目的基因导入微生物细胞：Ca2＋处理法
只有该步骤没涉及到
碱基互补配对现象　
将目的基因导入不同受体细胞的方法
受体细胞 常用方法 过程
植物细胞 花粉管 通道法 ① 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
② 植物受粉后剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，
使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
主要适用于 双子叶植物 和裸子植物 农杆菌 转化法 将目的基因插入Ti质粒的T DNA上（可转移的DNA）
→ 导入农杆菌 → 侵染植物细胞 → 含目的基因的T DNA
整合到受体细胞的染色体DNA上 → 筛选转化细胞并再生 成植株或培养植株并获得种子再进行筛选、鉴定
受体细胞 常用方法 过程
动物细胞 （受精卵） 显微注射技术 基因表达载体
↓
显微注射到受精卵
↓
发育成具有新性状的动物
原核生物 (大肠杆菌等) Ca2＋处理法 Ca2＋处理大肠杆菌 → 细胞处于能吸收周围
环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）
→将基因表达载体导入其中
将目的基因导入不同受体细胞的方法
容易表现出全能性
翻译
转录
目的基因
是否插入
mRNA
蛋白质
个体
检测
PCR等
技术
检测
PCR等
技术
检测
抗原—抗体
杂交
检测
抗虫、抗病
接种实验
分子水平检测
个体水平检测
6. 第四步：目的基因的检测与鉴定
目的基因检测与鉴定的“两个水平”
7. DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）实验基础：
① PCR原理：双链DNA 单链DNA
每次循环可分为变性、复性和延伸三步
② 电泳：DNA分子中的可解离基团，在一定的pH条件下会带上正电荷或负电荷。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
这个过程就是电泳。
③ 鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
等有关。
加热，双螺旋结构解体
缓慢冷却，
分离的DNA链又重新结合
7. DNA片段的扩增及电泳鉴定
（2）PCR实验操作步骤：
① 移液：按配方用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分。
PCR反应体系的配方：
组分 含量
10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液　 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
注：模板DNA的用量为1 pg～1 μg。
7. DNA片段的扩增及电泳鉴定
（2）PCR实验操作步骤：
① 移液：按配方用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分。
② 离心：使反应液集中在微量离心管的底部。
③ 反应：设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液的微量离心管放入PCR仪
中进行反应。
7. DNA片段的扩增及电泳鉴定
（3）DNA片段的电泳鉴定实验操作步骤：
① 制胶：提前将模具和梳子准备好，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，在沸水浴
或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量的核酸染料混匀，
倒入模具，并插入梳子。
② 形成加样孔：待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
③ 上样
a. 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
b. 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合
c. 用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，
留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
④ 电泳：接通电源，设定电压，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳。
⑤ 拍照：取出凝胶，置于紫外灯下观察和照相。
（4）DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，
可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）导入
动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白
的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。
下图为针对某种RNA病毒抗原(S蛋白)研制DNA疫苗和RNA疫苗的思路：
下列相关叙述正确的是(　　)
A. 该疫苗中核酸可作为抗原刺激人体产生体液免疫
B. 步骤①中对S蛋白基因进行扩增，
需要用到DNA聚合酶和解旋酶
C. 步骤②构建重组表达载体，
其S基因应插入载体，
只需不破坏标记基因
D. 核酸疫苗能在人体细胞中
成功表达S蛋白，说明了
生物界共用一套密码子
D
精题精练
谢谢
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