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新人教生物一轮复习学案
第39讲 基因工程
【素养目标】　1.结合生活或生产实例，举例说出基因工程的基本原理。(生命观念)　2.运用比较、归纳与概括的方法，理解限制酶和DNA连接酶的作用特点，运用结构与功能观，理解载体的结构特点及作用。(生命观念　科学思维)　3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验，写出实验报告并与他人进行必要的交流。(科学思维　科学探究)　4.运用演绎与推理、模型与建模，理解基因工程基本操作程序，进行简单的设计。(生命观念　科学思维)
考点一　重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
2．基本工具
(1)限制性内切核酸酶
【特别提醒】　将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
【拾遗补缺】　源于选择性必修3 P71“旁栏思考”
①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示　原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
②提示　限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
②类型
常用类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
【拾遗补缺】　源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体
(1)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　)
(2)限制酶只能用于切割目的基因(　　)
(3)限制酶也可以识别和切割RNA(　　)
(4)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　　)
(5)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因(　　)
答案　(1)×　(2)×　(3)×　(4)×　(5)×
1．与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
2.图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
[典例剖析]
(多选)(2022·辽宁卷，12)抗虫和耐除草剂玉米双抗12－5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
B　[预变性是使引物完全变性解开，A错误；后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确；延伸过程需引物参与，C错误；转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D错误。]
【名师点拨】　掌握信息转化能力
信息提取 信息1：PCR方法进行目的基因监测
信息2：预变性
信息3：延伸
信息转化 1.目的基因扩增
2.使引物完全变性解开
3.子链合成，需引物
素养考查 生命观念：结构与功能观 科学思维：逻辑思维能力
【角度转换】　提升语言表达能力
PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。
考向一　基因工程工具酶的应用
1．(2023·北京大兴高三期中)基因S与作物甜度相关，可用于培育转S基因作物新品系。如下图，为使S基因按正确方向与质粒连接，选用的限制酶组合是(　　)
A．XbaⅠ和SalⅠ B．EcoRⅠ和HindⅢ
C．BamHⅠ和HindⅢ D．XbaⅠ和HindⅢ
D　[质粒中SalⅠ的酶切位点没有位于启动子和终止子之间，不能选用，A错误；基因两侧都有酶切位点，不能定向连在质粒上，限制酶EcoRⅠ在目的，B错误；BamHⅠ会破坏目的基因，C错误；为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、Hind Ⅲ酶切割S基因的cDNA和载体，D正确。]
2．(2023·泉州高三模拟)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、BglⅡ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－↓GATC－)这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是(　　)
选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析
A． Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B． Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ Mbo Ⅰ 切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化
C． Mbo Ⅰ Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ 形成的重组质粒可被Mbo Ⅰ再次切开，但可能无法被Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ再次切开
D． Mbo Ⅰ Mbo Ⅰ 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化
B　[切割质粒和切割目的基因均用Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ，由于两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成的重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，A正确；切割质粒用Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ，切割后产生的黏性末端相同，切割后的质粒可能自我环化；切割目的基因用Mbo Ⅰ，切割后产生黏性末端，切割后的目的基因可以自我环化，B错误；切割质粒用Mbo Ⅰ，产生黏性末端，切割目的基因用Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ，产生黏性末端，形成的重组质粒中原来的Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ的切割位点的序列发生改变，不能再被这两种酶切割，但不影响Mbo Ⅰ的作用，C正确；切割质粒用Mbo Ⅰ，切割目的基因用MboⅠ，产生的均为黏末端，切割后的质粒可自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化，D正确。]
考向二　基因工程载体的应用
3．(2023·石嘴山高三检测)在重组DNA技术中，将外源基因导入受体细胞，通常是利用质粒作为载体。下列关于质粒的叙述，正确的是(　　)
A．质粒是一种只存在于原核细胞中的结构简单的环状DNA分子
B．质粒的复制和表达过程都遵循中心法则和碱基互补配对原则
C．目的基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达
D．大多数天然质粒都不需要人工改造，可以直接作为载体使用
B　[质粒是存在于许多细菌以及酵母菌(真核细胞)中的有自主复制能力的小型环状DNA分子，A错误；质粒的复制和表达都遵循中心法则，也遵循碱基互补配对原则，B正确；只需要将含有目的基因的质粒导入受体细胞，无需整合到受体细胞的DNA中也能表达，C错误；天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，D错误。]
4．(多选)(2023·东营高三检测)酵母菌的转录因子GAL4由DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)构成，BD和AD结构上分开、功能上独立。一般情况下，BD能与GAL4效应基因上游的特定DNA区段(UAS)相结合，AD则推动了转录的起始。若用基因工程的方法，将GAL4的AD和BD基因分别克隆到不同的载体上，将两个载体一起导入酵母菌，无法推动相应基因的表达。以下说法错误的是(　　)
A．在正常酵母菌细胞内，BD和AD能结合在一起
B．利用这项技术，可以用来验证两种蛋白质之间是否有相互作用
C．AD通过囊泡的形式释放到酵母菌外
D．BD能依据碱基互补配对原则与启动子结合
CD　[在正常酵母菌细胞内，BD和AD能结合在一起，形成转录因子，激活基因转录，A正确；利用这项技术，将两种蛋白X、Y分别与AD、BD融合，蛋白质X、Y有相互作用时，两结构域能重新呈现完整转录因子活性，故可验证两种蛋白质之间是否有相互作用，B正确；AD在酵母菌细胞内发挥作用，不释放到细胞外，C错误；BD是蛋白质，不能依据碱基互补配对原则与启动子结合，D错误。]
考点二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①根据已知结构和功能进行筛选。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①构建基因文库获取目的基因。
②利用PCR获取和扩增目的基因
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
4.目的基因的检测与鉴定
检测水平 检测目的 检测方法
分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR技术、核酸分子杂交技术
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交
个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验
(1)目的基因就是指编码蛋白质的基因(　　)
(2)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物(　　)
(3)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(　　)
(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达(　　)
(5)应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达(　　)
答案　(1)×　(2)√　(3)√　(4)√　(5)×
1．PCR技术相关分析
(1)PCR技术的过程
关于引物的2点提醒：①引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端；②只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
(2)PCR技术和DNA复制的比较
2．基因表达载体构建过程
如果用同一种限制酶切割，若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
[典例剖析]
(2022·河北卷，24)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPinlA)的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是______________________________________________。
(2)________________________________是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的________________上，此方法的不足之处是________________________________________________________________________。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有____________________________________________________________________(写出两点即可)。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的________________以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析____________(填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”)转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是________________________________________________________________________。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生____________。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是_________________(写出两点即可)。
答案　(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的　(2)基因表达载体的构建/表达载体的构建
(3)T DNA　该方法不适用于单子叶植物　(4)基因－DNA分子杂交技术、mRNA－分子杂交技术、抗原－抗体杂交技术　(5)效果　 NaPI　饲喂NaPI转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃数较对照组少　(6)定向改变　由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂
解析　(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的。
(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建。
(3)将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上，通过农杆菌的转化作用，把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。其不足之处是该方法不适用于单子叶植物。
(4)目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因、是否能转录出目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗虫性、抗病性、活性等。即可利用基因－DNA分子杂交技术、mRNA—分子杂交技术、抗原－抗体杂交技术等。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的效果以鉴定其抗性程度。由图可知，NaPI转基因棉花的抗虫效果最佳，因为饲喂NaPI转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃数较对照组少。
(6)在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂。
【名师点拨】　掌握信息转化能力
信息提取 信息1：蛋白酶抑制剂的抗虫
信息2：农杆菌转化法
信息转化 1.抑制胰蛋白酶活性
2.农杆菌中的Ti质粒上的T DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上
素养考查 生命观念：结构与功能观 科学思维：分析与综合能力
【角度转换】　提升语言表达能力
在构建含目的基因的重组Ti质粒载体过程中，目的基因序列中不能含有用到的限制酶的识别序列，原因是如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
考向一　目的基因的获取
5．(2023·天津高三检测)科学家拟培育转人溶菌酶基因山羊以大规模生产人溶菌酶(从乳汁中提取)，部分过程如图所示。质粒S中的标记基因Leu控制合成亮氨酸，标记基因GFP控制合成绿色荧光蛋白；四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。
限制酶 BamHⅠ BglⅡ HindⅢ XbaⅠ
识别字列和切割位点 G↓GATCC A↓GATCT A↓AGCTT T↓CTAGA
依据题目信息，下列能成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞的说法是(　　)
A．培养基中不加亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞不显示出绿色荧光
B．培养基中加入亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞不显示出绿色荧光
C．培养基中加入亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞显示出绿色荧光
D．培养基中不加亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞显示出绿色荧光
A　[用限制酶BamHⅠ、HindⅢ切割质粒S和目的基因，形成的重组质粒 T含有标记基因Leu和GFP基因，但BamHⅠ将GFP基因切割开，使得该基因失去遗传效应，而标记基因Leu控制合成亮氨酸，故培养基中不加亮氨酸，培养一段时间后观察，细胞不显示出绿色荧光的成纤维细胞是含有重组质粒T的细胞，B、C、D错误，A正确。]
6．(多选)(2022·日照高三检测)PCR中使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3′端加上多聚A。PCR扩增过程中，由于不清楚目的基因的完整DNA序列，获得的目的片段通常需要重组到T－载体中，通过测序了解DNA序列。LacZ基因在IPTG诱导下的表达产物能够水解X gal使菌落呈蓝色，否则呈白色。目的基因插入LacZ中会导致该基因失活，因此可采用蓝白斑法筛选含有重组质粒的大肠杆菌。下图为T 载体的结构示意图(Ampr为氨苄青霉素抗性基因)。下列说法正确的是(　　)
A．为高效连接PCR扩增产物，T－载体用EcoR Ⅴ酶切后再在3′端添加多聚T突出端
B．通过设计特定的引物借助PCR技术可检测PCR扩增产物在T－载体中的插入方向
C．选择BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切并构建基因表达载体以保证扩增产物正向插入
D．转化后，应选择在含X gal和氨苄青霉素培养基上生长的白色单菌落进行测序
AB　[结合题意可知，PCR中使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3′端加上多聚A，则经PCR扩增出的片段含有A的黏性末端，故T－载体用EcoR Ⅴ酶切后再在3′端添加多聚T突出端，A与T配对，可高效连接PCR扩增产物，A正确；通过设计特定的引物(如目的基因和目的基因外部的一对引物)借助PCR技术可检测PCR扩增产物在T－载体中的插入方向，B正确；据图可知，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的识别序列均在引物2中，不符合PCR扩增要求，应选择Pst Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切，以保证扩增产物正向插入，C错误；结合题意“LacZ基因在IPTG诱导下的表达产物能够水解X gal使菌落呈蓝色，否则呈白色”可知，转化后，应选择在含X gal和氨苄青霉素及IPTG的培养基上进行筛选，D错误。]
考向二　基因工程的基本操作程序
7．(2023·重庆高三检测下)图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作。若限制酶EcoR Ⅰ识别G↓AATTC，BamH Ⅰ识别G↓CATCC。下列选项正确的是(　　)
A．利用PCR技术扩增基因时，反应缓冲溶液中要添加Ca2＋来激活DNA聚合酶
B．构建基因表达载体时可使用E.coli DNA连接酶将DNA片段连接起来
C．农杆菌侵染人参细胞后Ti质粒整合到受体细胞的染色体DNA上
D．检测干扰素基因是否导入人参愈伤组织细胞需要利用抗原—抗体杂交
B　[PCR需要在一定的缓冲溶液中才能进行，反应体系中一般要添加Mg2＋来激活耐高温的DNA聚合酶，A错误；根据图示，用EcoRⅠ和BamHⅠ对目的基因和Ti质粒进行切割，产生黏性末端，而后可使用E．coliDNA连接酶将DNA片段连接起来，B正确；农杆菌侵染人参细胞后Ti质粒上的T DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，C错误；检测目的基因是否导入受体细胞常用DNA分子杂交技术，D错误。]
8．(2023·重庆高三检测)慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。地中海贫血症是一种在我国长江以南各省高发的单基因遗传病，研究者利用慢病毒载体建立相应转化系统，将患者的体细胞转化为多能干细胞，以获得用于自体移植的细胞。过程如下图所示，下列说法错误的是(　　)
A．基因表达载体中除了目的基因外，还有启动子、终止子和标记基因等
B．表达载体和包装载体转染包装细胞后得到的慢病毒具有侵染性
C．多能干细胞需要置于含有95%氧气和5%二氧化碳的培养箱中培养
D．培养成功转化的多能干细胞还需要诱导分化为造血干细胞用于治疗疾病
C　[基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等，A正确；图中将表达载体和包装载体导入包装细胞，一段时间后可以获得能够转化患者多能干细胞的慢病毒颗粒，具有侵染性，B正确；多能干细胞需要置于含有95%空气和5%二氧化碳的培养箱中培养，C错误；获得成功转化的多能干细胞后，诱导其定向分化为造血干细胞，然后植入患者骨髓，用于治疗地中海贫血症，D正确。]
考点三　基因工程的应用和蛋白质工程
1．基因工程的应用
表现方面 具体内容
在农牧业方面的应用 ①转基因抗虫植物；②转基因抗病植物；③转基因抗除草剂植物；④改良植物的品质；⑤提高动物的生长速率；⑥改善畜产品的品质
在医药卫生领域的应用 ①对微生物或动植物的细胞进行基因改造来生产药物；②利用基因工程技术，让哺乳动物批量生产药物；③用转基因动物作器官移植供体
在食品工业方面的应用 利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等
【特别提醒】　(1)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。
(2)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。
(3)原核生物的基因(如抗虫基因)可以作为真核生物(棉花)的目的基因。
(4)Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
2．蛋白质工程
(1)概念
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②手段：改造或合成基因。
③结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
(2)过程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
(3)蛋白质工程的应用
①利用蛋白质工程研发药物。
②利用蛋白质工程改进或开发新的工业酶。
③在农业方面，改造光合作用相关的酶。
(1)转基因抗病农作物不需要使用农药(　　)
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(　　)
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(　　)
(4)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质(　　)
(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构(　　)
答案　(1)×　(2)×　(3)×　(4)√　(5)×
1．乳腺生物反应器
(1)外源基因：药用蛋白基因。
(2)表达条件：药用蛋白基因＋乳腺中特异表达的基因的启动子。
(3)受体细胞：哺乳动物的受精卵。
2．工程菌
(1)概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
(2)外源基因：控制合成抗体、疫苗、激素等的基因。
(3)受体细胞：微生物细胞。
(4)特点：细菌内没有内质网、高尔基体等，产生的药物可能没有活性。
(5)药物提取：从微生物细胞中提取。
3．蛋白质工程与基因工程的异同
项目 蛋白质工程 基因工程
过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 筛选与获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 可生产自然界中不存在的蛋白质 只能生产自然界中已存在的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程
[典例剖析]
(2022·湖南卷，22)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是____________________，物质b是_______________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是________________________________________________________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有______________、________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是__________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是___________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)氨基酸序列(多肽链)　mRNA　密码子的简并性　(2)从基因文库中获取目的基因　通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成　DNA双链复制　(3)种类　提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏　(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
解析　(1)据材料分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA双链复制。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
【名师点拨】掌握信息转化能力
信息提取 信息1：蛋白质工程
信息2：抗凝血活性差异
信息转化 1.通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质
2.结构决定功能，抗凝血活性差异与空间结构有关
素养考查 生命观念：结构与功能观 科学思维：分析与综合能力
【角度转换】　提升语言表达能力
蛋白质工程基本途径是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)以上是蛋白质工程特有的途径。
考向一　基因工程的应用
9．(2023·阆中高三检测)1988年，美国默克公司以仅700万美元的价格，向我国全部转让当时最先进的重组乙肝疫苗的生产技术。该技术利用酿酒酵母来表达乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)，然后将表面抗原(HBsAg)纯化后混合佐剂制成乙肝疫苗。下列相关说法错误的是(　　)
A．传统乙肝疫苗的生产方式是在培养液中培养乙肝病毒，再对乙肝病毒进行减毒或灭活处理
B．HBsAg基因能导入酵母中仍能成功表达，是由于酵母和乙肝病毒共用一套遗传密码
C．科学家不选大肠杆菌作受体，可能是因为HBsAg需要依赖内质网和高尔基体进行后期加工和包装
D．该技术的原理是基因重组，通过该技术生产出的疫苗化学本质是蛋白质
A　[病毒营寄生生活，不能独立代谢，只有寄生在宿主活细胞内才能生存和繁殖，所以乙肝病毒不能在培养液中直接培养，而是通过宿主活细胞才能培养，A错误；几乎所有生物体都共用一套密码子，所以HBsAg基因能导入酵母中仍能成功表达，B正确；大肠杆菌是原核生物，只含有核糖体这一种细胞器，而HBsAg的表达，需要核糖体的合成、内质网和高尔基体进行后期加工和包装，所以不能使用大肠杆菌作为受体，C正确；由题干分析可知，该技术是以乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)对应的基因为目的基因，与酿酒酵母进行DNA重组，后通过基因表达，表达出乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)，所以该技术的原理是基因重组，通过该技术生产出的疫苗化学本质是蛋白质，D正确。]
10．(多选)(2023·南京高三检测)研究人员仿照制备乳腺生物反应器的思路，制备了一种膀胱生物反应器，用其获得人体特殊功能蛋白A的基本过程如下图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
A．步骤①和②所代表的操作分别是显微注射、体外受精
B．诱导雌性动物超数排卵所饲喂的激素只能作用于特定细胞
C．通过超数排卵获得的卵子可直接与获能的精子进行体外受精
D．早期胚胎培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸
ABD　[受精卵的全能性最大，利用受精卵作为重组表达载体的宿主细胞常采用①显微注射的方法将载体注入，继而对受精卵进行早期胚胎的培养(②)，A错误；诱导雌性动物超数排卵的激素是促性腺激素，该激素是由垂体分泌的，属于蛋白质(多肽类)激素，不能饲喂，只能注射，否则会被分解，B错误；通过超数排卵获得的卵子可直接与获能的精子进行体外受精，原因是卵子已在输卵管中发育至MⅡ期(卵子已具备受精能力)，C正确；早期胚胎培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2的作用是维持培养液的pH，D错误。]
考向二　蛋白质工程
11．(2021·辽宁卷，14)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(　　)
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
D　[在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。]
12．(2023·重庆高三检测)T4溶菌酶在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程对T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键，获得了热稳定性高的T4溶菌酶。下列说法正确的是(　　)
A．蛋白质工程与中心法则的流程方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质
B．不能利用抗原—抗体杂交的方法对该酶进行检测
C．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
D．上述改造过程会使基因发生定向改变，产生一种全新的基因
D　[蛋白质工程与中心法则的流程方向相反，A错误；T4溶菌酶本质为蛋白质，可利用抗原—抗体特异性结合的特点对该酶进行检测，B错误；蛋白质工程和基因工程都要对基因进行操作，其操作对象相同，C错误；获得T4溶酶菌的过程需要对基因进行改造，进而表达出不一样的蛋白质，该过程使基因发生定向改变，产生一种全新的基因，D正确。]
考点四　DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。
③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
(2)操作流程
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300__nm的紫外灯下被检测出来。
【注意事项】　(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(1)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色(　　)
(2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精(　　)
(3)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存(　　)
(4)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关(　　)
(5)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换(　　)
答案　(1)×　(2)√　(3)×　(4)×　(5)×
考向一　DNA的粗提取与鉴定
13．(2022·山东卷，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　)
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B　[低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；第一次离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有些蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。]
14．(2021·山东卷，13)粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(　　)
A．加入适量的木瓜蛋白酶
B．37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟
C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精
D．加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
A　[木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60～75 ℃的水浴箱中保温10～15分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。]
考向二　DNA片段的扩增及电泳鉴定
15．(2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
D　[增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，B、C错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低而造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。]
16．(2023·南通高三检测)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是(　　)
A．该图表示PCR循环中的变性环节
B．PCR第四次循环要消耗15对引物
C．Taq酶催化相邻的两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键
D．用图中引物扩增两个循环后即可获得添加限制酶切点的产物
D　[图中引物与模板链碱基互补配对，该图表示PCR循环中的复性环节，A错误；PCR三次循环共消耗7(23－1)对引物，PCR四次循环共消耗15(24－1)对引物，第四次循环要消耗8对引物，B错误；dNMP只有一个磷酸基团，为脱氧核苷酸，dNTP有三个磷酸基团，延伸时，在Taq酶催化下，dNMP作为扩增的原料会依次连接到3′端，相邻的dNMP间形成磷酸二酯键，C错误；由于一个引物不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的一个DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，通过绘图可推知，再经过一次循环，产物中开始出现脱氧核苷酸链等长的DNA片段，所以扩增两个循环后即可获得添加限制酶切点的产物，D正确。]
(三十九)基因定点突变技术
1．基因定点突变技术概念：基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。
2．基因定点突变技术的类型：
(1)PCR定点突变技术
PCR定点突变技术是最常用的基因定点突变技术，通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。PCR定点突变技术具有突变回收率高、可在任何位点引入突变、材料和试剂容易获得、操作简单等优点，它又可以分为重叠延伸PCR、大引物PCR等。
①重叠延伸PCR
重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。如图所示，该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
②大引物PCR
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。
(2)不依赖PCR的定点突变技术
不依赖PCR的定点突变技术的核心是人工合成带有突变位点的寡核苷酸片段，再借助在宿主细胞内的复制过程来实现定点突变。这类技术中比较成熟的有盒式突变、寡核苷酸引导的突变等。盒式突变的原理是，利用一段人工合成的含有突变位点的双链寡核苷酸片段来替换目的基因中相应的片段，从而在目的基因中引入突变位点。寡核苷酸引导的突变的技术流程如图所示。
首先人工合成一段含有特定突变位点的单链寡核苷酸片段(除突变位点外，该片段的其他部分可以与目的基因互补配对)；然后将该寡核苷酸片段与带有目的基因的单链载体(通常由M13噬菌体衍生而来)进行杂交；继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下分别进行DNA链的合成和连接反应，得到含有突变位点的双链载体；最后将双链载体引入宿主细胞进行复制，并进行筛选和鉴定。
[对点训练]
1．(2023·南京高三检测)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是(　　)
A．两轮PCR过程中退火时的温度一样
B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR的产物DNA的两条链
D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
D　[为了使引物与模板链准确配对，引物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一轮高，A错误；单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；除第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；蛋白质工程是指通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。]
2．(2022·河南六市重点高中高三联考)定点突变技术是按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。其中一种方法是利用寡核苷酸链介导的定点突变，过程如图所示。下列关于利用寡核苷酸链介导的定点突变技术的叙述，错误的是(　　)
A．该技术的原理是基因发生碱基对的替换
B．过程①需要模板、原料、能量、酶等基本条件
C．过程②以寡核苷酸链延伸后的单链为模板
D．过程①②均遵循碱基互补配对原则
A　[定点突变改变特定位点的核苷酸，先是诱变寡核苷酸引物上的碱基对发生取代、插入或缺失，随后经过延伸和复制，产生新的突变基因，A错误；该延伸过程属于DNA复制过程，需要模板、原料、能量、酶等基本条件，B正确；题图显示过程②以寡核苷酸链延伸后的单链为模板合成互补DNA链的过程，C正确；延伸过程遵循碱基互补配对的原则，需要DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸，D正确。]
1．(2021·浙江6月选考，20)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是(　　)
A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B．基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子官，才可获得表达EGFP的小鼠
C．分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎
B　[依据胚胎在不同发育阶段对培养条件的特定需要，受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液，A正确；基因编辑处理的受精卵一般经体外培养至桑葚胚或囊胚阶段，进行胚胎移植，可获得表达EGFP的小鼠，B错误；分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植、早期胚胎培养、胚胎移植等技术，可获得大量的转基因小鼠，C正确；由题意分析可知，通过基因编辑技术将Y染色体用绿色荧光蛋白基因标记，通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的个体含有Y染色体，即为雄性小鼠胚胎，D正确。]
2．(2021·湖北卷，7)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为(　　)
A．6 B．250
C．4 000 D．24 000
C　[据图可知，EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4 096，即4 096≈4 000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 000。C符合题意。]
3．(2022·山东卷，25)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG P和FLAG PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是__________________________________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是__________________________________。
修改扩增P基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG P、FLAG PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG P和FLAG PΔ不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是__________________________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，PΔ中缺失的特定序列的作用是_____________________________________________。
注：DNA编码链为转录时所用模板链的互补链
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是_______________________________。
答案　(1)两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对　5′端　(2)EcoR Ⅰ的插入导致转录形成的mRNA中P基因的密码子读取顺序发生改变　扩增P基因时引物除含有EcoR Ⅰ序列外再添加一个核苷酸
(3)促进UBC与FLAG P的结合　与UBC相结合　(4)药物A促进UBC与FLAG P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
解析　(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。
(2)据图中信息分析，P基因编码链起始序列“ATGTGCA”中的第一个碱基A与EcoR Ⅰ识别序列最右侧的两个碱基在转录后编码氨基酸时构成了一个密码子，导致P基因的密码子读取顺序发生改变，从而导致P基因对应的氨基酸序列与P不同。扩增P基因时引物除含有EcoR Ⅰ识别序列外再添加一个核苷酸，可以使P基因转录形成的mRNA正常翻译出正确的氨基酸序列。
(3)由①②③组结果的差异可以看出，加入药物A后检测出的UBC与其抗体结合的条带更宽，因此可以推测，药物A的作用是促进UBC与P蛋白的结合；由②④组和③⑤组的比较可以看出，PΔ不能与UBC结合，由此推测，PΔ中缺失的特定序列的作用是与UBC相结合。
(4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
4．(2021·福建卷，21)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为________________。
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用__________酶将载体P切开，再用__________(填“T4DNA(T4DNA)或“E.coli81DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的__________和__________，选用__________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用____离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是____________________________________________________。
答案　(1)引物1和引物4　(2)①EcoR Ⅴ　T4DNA(T4DNA)　②启动子　终止子　Xho Ⅰ和Pst Ⅰ　钙
(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
解析　(1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。
(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ酶将载体P切开；由于E.coli81DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA(T4DNA)连接酶可以连接平末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②载体P′是重组质粒，故不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有Xho I和Pst I酶，故可选用Xho I和Pst I酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。
(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。

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