资源简介

(共36张PPT)
第二节 基因工程的基本操作程序
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
问题探讨
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
目的基因
受体细胞
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
第一步：目的基因的筛选与获取
什么是基因
基因通常是有遗传效应的DNA片段
基因定义：
基因片段
非基因片段
原核生物的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游：启动子
编码蛋白质，连续不间断
编码区下游：终止子
真核生物的基因结构
非编码区
编码区
非编码区
外显子：编码蛋白质
内含子：不编码蛋白质
初级转录产物
成熟mRNA
剪接
mRNA
逆转录
cDNA
无剪接过程
第一步：目的基因的筛选与获取
一、目的基因
（1）概念：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；
与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（Bt抗虫蛋白基因）。
主要是编码特定蛋白质的基因
（2）实例：
如何筛选目的基因
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
对Bt基因的表达产物--对Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
二、筛选合适的目的基因
第一步：目的基因的筛选与获取
方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
二、筛选合适的目的基因
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
第一步：目的基因的筛选与获取
随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。
目的基因如何获取
第一步：目的基因的筛选与获取
三、目的基因的获取
方法：
1.人工合成
2. PCR获取和扩增目的基因
3. 构建基因文库（p82）
基因组文库
cDNA文库
基因文库：把某种生物基因DNA通过酶切获得大量DNA片段，然后将这些片段与载体连接，再转入受体菌中，这样整个菌群克隆就包含该生物的全部基因片段，称为基因文库。
PCR技术
第一步：目的基因的筛选与获取
聚合酶链式反应，根据DNA半保留复制的原理，在体外（PCR扩增仪）提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
概念：
体外模拟DNA复制，实现快速扩增DNA
PCR扩增仪
第一步：目的基因的筛选与获取
DNA复制所需的基本条件：
参与组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（体外用高温代替）
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
打开DNA双链
使DNA聚合酶能够从引物的3`端开始连接脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
DNA聚合酶不能直接发起子链的合成，只能催化单个核苷酸加到3`端而延伸子链
什么是引物？
第一步：目的基因的筛选与获取
PCR反应体系中有哪些必需的物质：
DNA模板
2种引物
原料：
耐高温的DNA聚合酶
Mg+ ： 激活DNA聚合酶
有两条模板链
四种脱氧核苷酸
PCR扩增的过程：
1.目的基因DNA受热变性后解为单链（解旋）
变性
2.引物与单链相应互补序列结合
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下延伸，即将四种脱氧核苷酸加到引物的3`端。
复性
延伸
PCR反应过程示意图：
第一轮循环：（每次循环分为变性、复性、和延伸三步。）
变性：解旋
PCR反应过程示意图：
第一轮循环：（每次循环分为变性、复性、和延伸三步。）
复性的过程只有引物与DNA模板链结合吗？
不一定，也存在解开的两条DNA单链的结合，
原因：①引物较短，更容易结合；②引物量多，引物与模板的碰撞结合机会更高。
引物结合概率更高。
PCR反应过程示意图：
第一轮循环：（每次循环分为变性、复性、和延伸三步。）
子链延伸方向从5`端到3`端
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。
第二轮循环
第三轮循环
指数形式扩增：2n（n代表扩增循环的次数）
PCR反应过程示意图：
PCR扩增形式：
PCR反应过程都在PCR扩增仪中自动完成。
PCR反应过程：变性、复性和延伸
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
如何判断PCR扩增是否成功？
一次成功的PCR扩增应产生与预期大小一致的DNA片段。
Marker
旁栏思考
用PCR可以扩增mRNA吗？
不能，RNA不稳定，不能直接作为模板，需要将mRNA逆转录为cDNA（RT-PCR），然后再进行扩增。
mRNA
逆转录酶
杂交双链
DNA链
mRNA链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
cDNA
一般不可以，游离的DNA片段容易被分解，并且无法进行复制，更不能遗传给下一代。
获得目的基因之后可以直接导入受体细胞吗？
第二步：基因表达载体的构建
（核心）
一、基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
二、基因表达载体的组成
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）
人们所需要的基因
位置：
功能：
基因的下游（一段特殊的DNA片断）
终止转录
便于重组DNA分子的筛选和鉴定
三、基因表达载体的构建过程
基因表达载体构建模式图
产生相同末端（同一种限制酶）
培育抗虫棉的简要过程
只使用一种DNA限制酶进行切割（单酶切） ，会有那些连接情况？
使用2种限制酶（双酶切）同时对目的基因和质粒切割，防止自连环化和随意连接。
载体
目的基因
自连环化
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
2
2’
正向连接
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
思考
反向连接
1’
方法
植物细胞
农杆菌转化法（常用）
花粉管通道法（我国独创）
——显微注射法(p82)
——Ca2+处理法(p82)
第三步：将目的基因导入受体细胞
动物细胞
微生物细胞
花粉管通道法—植物细胞
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
第三步：将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法示意图
显微注射法—动物细胞
目的基因的表达载体
显微注射
到受精卵中
受精卵发育
获得具有新性状的动物
显微注射技术
①体积大，易操作
②全能性高
第三步：将目的基因导入受体细胞
Ca2+处理法--- 原核细胞
（1）使用Ca2+处理：
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
（2）过程
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
大肠杆菌细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
感受态
繁殖快，结构简单
大肠杆菌（p82）
检测是否插入目的基因
检测目的基因是否转录
检测目的基因是否翻译
基因表达的过程
生物是否具有新性状
第四步：目的基因的检测和鉴定
分子水平的检测
个体生物学水平的检测
DNA
蛋白质
mRNA
性状
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
目的：
检测内容：
分子水平的检测
（1）基因是否插入(DNA)
（2）目的基因是否转录(mRNA)
方法：
1.PCR技术
2.分子杂交技术
需逆转录为cDNA再进行PCR鉴定
探针
32P
变性
变性
碱基互补配对原则
杂交DNA分子（可检测）
32P
目的DNA
目的RNA
（3）目的基因是否翻译
方法:
抗原-抗体杂交技术
个体生物学水平的检测
抗虫鉴定、抗病鉴定、抗逆鉴定等
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫
害虫死亡
病毒感染（病毒接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
第四步：目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
第一步：目的基因的筛选和获取
第二步：基因表达载体的构建
第三步：将目的基因导入受体细胞
利用PCR获取和扩增
人工合成；构建基因文库
目的基因、标记基因、启动子、终止子
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、Ca2+处理法(微生物)
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
---核心
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1、DNA体外扩增的原理
① PCR利用了DNA热变性的原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合
② PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环
2、DNA片段电泳鉴定的原理
① DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳
② 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关
③ 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来
一、实验原理：
二、材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR仪
微量移液器
电泳装置
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶（耐高温）、模板DNA
扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料等
微量离心管
电泳槽
电泳仪
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
最后加
三、方法步骤
DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min — —
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后一次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
5-10min
确保模板DNA完全变性
总延伸：确保所有片段充分延伸
三、方法步骤
与DNA结合，使其在紫外灯下发出荧光
8：凝胶载样缓冲液（内含指示剂）
4：核酸染料：
1.指示电泳进度
溴酚蓝
2.增加PCR产物密度,确保其均匀沉入加样孔内
指示分子大小的标准参照物：
Marker
DNA片段的扩增及电泳鉴定
三、方法步骤
保持试剂最大活性及稳定性
注意2：冰上缓慢融化：
四、注意
DNA片段的扩增及电泳鉴定
五、结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
在紫外灯下观察：DNA条带的分布及粗细程度
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？
1.没有条带：
期望只有一条目的带
漏加了PCR组分；
各组分用量不当；
PCR程序设置不当
2.不止一条条带：
引物设计不合理：
模板受到污染
退火（复性）温度过低
引物在模板链上不止一个结合位点
引物太短
课后作业
P83：练习与应用
小册子检测案13

展开更多......

收起↑