资源简介

(共21张PPT)
基因工程的基本操作程序（一）
棉铃虫
棉铃虫
（死亡）
00
培育抗虫棉的简要过程
苏云金芽孢杆菌
提取
普通棉花(不抗虫)
棉花细胞
与载体DNA拼接，导入
棉花植株(抗虫)
( 含抗虫基因 )
表达抗虫基因
抗虫基因（BT毒蛋白基因）
农杆菌
00
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
01
目的基因的筛选与获取
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据需求的不同，目的基因也不同，主要指编码蛋白质的基因，如遇生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
目的基因
01
目的基因的筛选与获取
知识回顾
必修二：请从DNA水平上给基因下一个定义，要求既能反映基因与DNA的关系，又能体现基因的作用。
基因通常是有遗传效应的DNA片段
但一段DNA片段不一定是基因
--A TGCATGC ATCGATGCTAGCGATCGC TAAGCAC AG---
--T ACGTACG TAGCTACGATCGCTAGCG ATTCGTG TC---
基因1
基因2
非基因片段
启动子
内含子
内含子
终止子
外显子
外显子
真核生物基因的结构
01
目的基因的筛选与获取
筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因的原因
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
对Bt基因的表达产物--对Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。（教材P76）
01
目的基因的筛选与获取
去哪里找？
NCBI
Gene Bank
BLAST
01
目的基因的筛选与获取
如何获得？
复制
复制
复制
复制
复制
聚合酶链式反应（PCR）
01
目的基因的筛选与获取
聚合酶链式反应（PCR）
根据DNA半保留复制的原理，在体外（PCR扩增仪）提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
01
目的基因的筛选与获取
聚合酶链式反应（PCR）
解旋酶
DNA聚合酶
母链(模板链)
子链(新合成的链)
四种脱
氧核苷酸
3’
5’
3’
5’
5’
体外用高温代替！
引物
解旋酶和高温都能使DNA的氢键断裂，使DNA的两条链解旋。
01
目的基因的筛选与获取
聚合酶链式反应（PCR）
▲引物:
在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链，必须由引物提供3′端之后才能开始连接脱氧核苷酸。
是能与DNA母链互补配对的一小段短单链核酸序列.
RNA单链、DNA单链
由于DNA双链是反相平行的，所以需要两种引物。
引物启动DNA的复制
01
目的基因的筛选与获取
聚合酶链式反应（PCR）
☆说明：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA有羟基(-OH)的一端称为3’端，而没有羟基的一端称为5’端。DNA的合成方向总是从5’ 端到3’端延伸。
01
目的基因的筛选与获取
DNA模板
Step1：加热至90℃以上使双链分开
Step2:冷却至50℃左右使引物与DNA结合
引物
Step3:DNA合成
+DNA聚合酶
+dATP +dGTP
+dCTP +dTTP
第一轮的产物
①变性
90℃以上
②复性
③延伸
冷却
加热
50℃左右
引物模板结合
72℃左右
DNA从5’ 端到3’端延伸。
72℃时，
01
目的基因的筛选与获取
第一轮产物
①变性
②复性
③延伸
循环
01
目的基因的筛选与获取
思考1
复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
思考2
用PCR可以扩增mRNA吗？
不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增
单链RNA
逆转录酶
杂交双链
DNA链
RNA链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
PCR扩增
01
目的基因的筛选与获取
思考3
获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？
第二轮产物
PCR扩增
三次才能得到目的基因
如何对产物进行检测鉴定？
01
目的基因的筛选与获取
思考4
如何对产物进行检测鉴定？
琼脂糖凝胶电泳
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
02
基因表达载体的构建
思考5
获得目的基因之后直接转入受体吗？
不是
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
解决办法？
思考5
质粒
细菌染色体
植物染色体
细胞核
表达载体
02
基因表达载体的构建
基因表达载体的作用：
① 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；
② 使目的基因能够表达和发挥作用。
☆基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
启动子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。
终止子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录。
02
基因表达载体的构建
02
基因表达载体的构建
思考
限制酶的选择
构建载体时，需要用同种限制酶切割载体和目的基因，以获得相同的黏性末端，便于两者顺利连接。但是由于被切割后的质粒本身也具备相同的黏性末端，所以会有一定概率的自身环化，你有办法解决这个问题吗？请提出自己的看法。

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