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第2章 细胞工程
第3节 动物细胞工程
Part3 动物细胞融合技术与单克隆抗体
01 动物细胞融合技术
在一定的条件下将两个或多个动物细胞，通过物理、化学或生物方法，结合形成一个细胞的技术。
形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞
细胞膜的流动性
1、概念：
4、结果：
2、原理：
3、诱导方式
物理法：电融合法
化学法：聚乙二醇（PEG)
生物法：灭活病毒诱导法
与植物原生质体融合的方法相同
——动物细胞融合特有
灭活的病毒粘附使细胞凝聚
细胞膜融合
细胞膜打开
细胞核融合
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合实质及完成的标志：细胞核的融合
灭活病毒诱导细胞融合的原理
【拓展】
01 动物细胞融合技术
01 动物细胞融合技术
正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞
6、应用：
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
5、意义：
至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。
研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育 生物新品种等的重要手段。
为制造单克隆抗体开辟了新途径。
①
①
②
③
④
⑤
⑥
植物体细胞杂交技术
杂种细胞
去除细胞壁
原生质体融合
细胞壁再生
脱分化
再分化
移栽
杂种植株
植物组织培养
原生质体融合
（植物细胞的全能性）
（细胞膜的流动性）
植物体细胞杂交技术完成的标志
植物体细胞杂交技术
具备两个亲本的遗传物质
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
步骤
诱导方法
结果
意义
比较动物细胞融合与植物体细胞杂交
细胞膜的流动性和植物细胞的全能性
细胞膜的流动性
酶解法去掉细胞壁后，诱导原生质体融合，形成杂种体细胞，再经过植物组织培养形成杂种植株
分散成单个细胞后诱导细胞融合
物理方法、化学方法
物理方法、化学方法、灭活病毒
形成杂种植株
形成杂种细胞
克服远缘杂交不亲和障碍
02 单克隆抗体及其应用
1.定义：机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
2.抗体的分布：
1）血清（主要）
2）组织液及外分泌液（如乳汁中）
体液免疫
抗体
1）每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体
2）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上
抗体
传统抗体制备方法及缺陷
不能无限增殖产生大量抗体
动物体内
抗原
刺激
多种浆细胞
多种抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
抗原不纯
缺点： 产量低、纯度低，特异性差
二、单克隆抗体及其应用
体内产生的特异性抗体多达百万种
每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体
如何获得大量的单一抗体
单
克 隆
抗 体
如何获得大量、单一的抗体？
体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖
1.需解决问题：
2.遗憾：
如何解决这一难题？
一个B淋巴细胞
细胞群
抗体
克隆
二、单克隆抗体及其应用
因为能产生抗体的B淋巴细胞属于高度分化的细胞
１.我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的
思考.讨论
２.有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和无限增殖能力同时具备
癌细胞
动物细胞融合
二、单克隆抗体及其应用
一个极富创造力的方案：
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
二、单克隆抗体及其应用
单克隆抗体技术手段：
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜的流动性、细胞增殖
原理：
优点：
特异性强、灵敏度高、可大量制备
注射特定抗原从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合小鼠的脾脏中获取2、单克隆抗体的制备过程02单克隆抗体及其应用PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法能产生抗体，但不能大量增殖不能产生抗体，但能大量增殖
2
杂交瘤细胞(多种)
1
3
置于选择性培养基上培养
第一次筛选
融合的细胞
BB
1
3
2
B
B瘤
瘤瘤
瘤
√
02 单克隆抗体及其应用
克隆化培养
抗体检测
第二次筛选
(抗原-抗体杂交技术)
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
阳性细胞
杂交瘤细胞(多种)
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
96孔板
阳性孔
02 单克隆抗体及其应用
体外培养体内或体外培养能分泌所需抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔项目体内培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高02单克隆抗体及其应用体外培养单克隆抗体体内或体外培养能分泌所需抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔灵敏度高特异性强可大量制备02单克隆抗体及其应用第一次筛选（1）筛选原因：诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞。骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合（2）筛选方法：用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种融合后形成的细胞（“B-B细胞”、“瘤-瘤细胞”）都会死亡，只有杂交瘤细胞（“B-瘤细胞”）才能生长。杂交瘤细胞选择培养基（3）筛选目的：得到杂交瘤细胞。注意说明第二次筛选（1）筛选原因：由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选获得的杂交瘤细胞中存在产生其他抗体的细胞。（2）筛选方法：用多孔培养皿培养，在每个孔内只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群。（3）筛选目的：得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞多孔培养板克隆化培养和抗体检测筛选抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞既能迅速大量增殖又能产生特异性抗体注意说明
02
阳性孔
抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法
在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
多孔细胞培养板
抗体检测板
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
02单克隆抗体及其应用动物细胞融合动物细胞培养给小鼠注射特定的抗原B淋巴细胞（免疫）骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞单克隆抗体能分泌所需抗体的杂交瘤细胞第一次筛选第二次筛选诱导融合选择培养基克隆化培养，抗体检测体外培养或小鼠腹腔内增殖灵敏度高特异性强可大量制备既能大量繁殖又能产生抗体(4)(多选)上图第一次筛选利用的一种特殊的选择培养基——加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”，其筛选原理是：核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径(如图)，正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。
下列有关叙述不正确的是(　 　)
A.浆细胞及其互相融合细胞因全合成途径被A阻断而在HAT培养基上不能增殖
B.骨髓瘤细胞及其互相融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖
C.杂交细胞因为可以进行上述两个途径所以能在HAT培养基上大量增殖
D.在HAT培养基上筛选出的所有杂交细胞既能大量增殖又能产生高纯度的目标抗体
ACD
（1）制备单克隆抗体靶向制剂。这些单克隆抗体靶向制剂对肿瘤细胞有较好的选择性杀伤作用。
抗体—药物偶联物（ADC）
1）组成：ADC=抗体+连接物+药物（如细胞毒素）
2）原理：单克隆抗体与肿瘤细胞表面的特定抗原专一性结合，使药物定向作用于肿瘤细胞。
3）优点：用药量小、疗效高、毒副作用小。
拓展
02 单克隆抗体及其应用
3、单克隆抗体的应用
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC（抗体-药物偶联物）
主要用于癌症治疗
运载药物
优点：位置准确、疗效高、副作用小
单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞
02 单克隆抗体及其应用
3、单克隆抗体的应用
（2）单克隆抗体可以高度特异性地识别抗原，它在疾病诊断上也有一定的临床价值。
实例一：肿瘤可能在血清等体液中表达某些抗原，单克隆抗体可以用来检测这些相关抗体是否表达及其表达水平，辅助肿瘤诊断。
实例二：用同位素标记某种单克隆抗体，可以诊断结肠癌肿瘤病灶是否已经转移等。
（3）尝试利用同位素标记的单克隆抗体在体内显示肿瘤位置，用以指导手术范围。这样既可以彻底地切除肿瘤，又可以避免切除过多的健康组织，以提高患者手术后的生活质量。
02 单克隆抗体及其应用
1、诊断试剂——最广泛应用
抗原-抗体杂交技术
抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体
在妊娠第8天就可以作出诊断，
比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。
具有准确、高效、简易、快速特点
诊断优点：
3、单克隆抗体的应用
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
血型检测试剂
新冠病毒检测试剂
02 单克隆抗体及其应用
单克隆抗体+同位素（荧光标记）
在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
结合荧光标记的单克隆抗体药物
02 单克隆抗体及其应用
1、诊断试剂——最广泛应用
3、单克隆抗体的应用
2、治疗疾病
医药领域，单抗类药物占用重要地位
02 单克隆抗体及其应用
3、单克隆抗体的应用
单克隆抗体的应用资料1用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。资料2使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。3、单克隆抗体的应用抗体药物接头ADC被细胞吞噬释放药物溶酶体裂解细胞凋亡1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？讨论：抗体：主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物：发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。特点
分布
类型
呈圆球形或椭圆球形，细胞体积小，核相对较大
存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
包括胚胎干细胞和成体干细胞、多能干细胞等。
干细胞的概念：
动物（包括人）胚胎及某些器官中同时具有自我更新能力分化能力的细胞。
三、干细胞的培养及其应用
胚胎干细胞
分布
特点
局限性
实例
早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
需要分化诱导因子诱导
ES细胞
三、干细胞的培养及其应用
成体干细胞
分布
特点
运用实例
实例
成体组织或器官内
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力
①造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）
②神经干细胞（神经系统中）
③精原干细胞（睾丸中）
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
造血干细胞→
神经干细胞→
发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例
全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞的比较
三、干细胞的培养及其应用
干细胞技术应用于新药研制和开发
1．胚胎干细胞可分化出任何组织类型的正常细胞，这为开发新药提供大量的标本，大大减少了新药研究所需的动物数量，降低了研究成本，也改进了研发药品及其安全性检验的方法。
2．利用人类干细胞或用干细胞培养出来的组织、器官测试各种药物的药效、毒理特性，会比用其他动物（如小鼠）更能反映人体的状况，这可能发展成为一种新的药物筛选模式。
3．对人胚胎干细胞的研究，可以帮助人们理解复杂的人体发育过程，并促进对人胚胎发育的基础研究，揭示人的发育机制及影响其发育的因素。
三、干细胞的培养及其应用

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