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第3章 基因工程工程
第1节 基因工程及其技术
（第三课时）
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
利用PCR获取和扩增目的基因：
1.发明者
DNA半保留复制
原理
体外
操作环境
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
目的
可在短时间内大量
扩增目的基因
优点
聚合酶链式反应
全称
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR
利用PCR获取和扩增目的基因：
PCR技术所需的基本条件
参与的组分 在PCR中的作用
模板DNA
4种dNTP
耐高温的DNA聚合酶
引物对
一定的缓冲溶液(Mg2＋)
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
2.所需的基本条件
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
脱氧腺苷三磷酸（dATP）
腺嘌呤脱氧核苷酸
脱氧腺苷二磷酸（dADP）
脱氧腺苷（dA)
腺嘌呤
脱氧
核糖
P
P
P
~
~
OH
H
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。
拓展：dNTP ——脱氧核苷三磷酸
拓展：引物
A T C G A A T C G G T T
T A C C T T A G C C A A
DNA
聚合酶
母链
DNA
子链
DNA
引物
3′
3′
5′
5′
DNA聚合酶
①因为DNA复制时，子链延伸的方向都是从5’→3’端
②DNA聚合酶不能从头合成子链，只能从引物的3’端延伸DNA链
拓展：引物
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
PCR扩增的前提是：
根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物（不需要整个目的基因的碱基序列）
由于DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增，PCR扩增时至少需要2种引物
引物的作用：定位目的基因的位置，与模板链结合，并为子链的延伸提供起点。
【现学现用】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
△设计两种引物的要求：
②引物自身不能环化
①两种引物之间不能互补配对
③引物长度不宜过短（用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸），防止引物随机结合
PCR扩增仪
DNA分子电泳
3.所需设备
利用PCR获取和扩增目的基因：
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种（dNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
退火（复性）
延伸
温度上升到约94℃，双链DNA解旋为单链
当温度下降到约55℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
4.过程
利用PCR获取和扩增目的基因：
利用PCR获取和扩增目的基因：
5.PCR的结果
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
问题: PCR技术与DNA复制过程比较？创P64
思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。
原因是：
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的
碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
思考：扩增几次可以得到只含目的基因的片段？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
(5)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)？
提示　第3轮，如图所示：
(1)1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出2n个DNA片段。经过 次循环后，刚好得到所需的目的基因;
(2)若开始有N个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。　　　　
N 2n
3
结果：
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，因而
每一次循环后目的基因的量可以增加_____，即呈_____形式扩
增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
PCR过程可以在 中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物
原理：（1）DNA分子在碱性缓冲液中带负电，在外加电场的作用下会向正极移动，分子质量越小，迁移速率越快；
（2）凝胶中的DNA分子可通过核酸染料染色被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增仪
产物鉴定：
产物鉴定：
（1）Marker（M）：标准样，一个已知分子质量的DNA样品作为对照，用来确定待测样品中DNA的相对分子质量。
产物鉴定：
(2)DNA荧光条带:
①条带的有无:代表是否成功扩增出待测样品中的DNA。若无条带，常见原因有:无DNA模板，引物设计不合适。
②条带的亮度:代表扩增的DNA数量，越亮代表DNA数量越多
③条带的位置:常代表DNA的大小。一般距离点样孔越远，说明跑的越快，DNA的分子质量越小。

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