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第三章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因及其表达产物的检测鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
基因工程的基本操作程序
（4个步骤）
01
目的基因的获取
一、获取目的基因的方法
（一）化学方法直接人工合成目的基因
1．DNA合成仪人工合成
对于比较小的目的基因，在明确脱氧核苷酸序列后，可以通过DNA合成仪人工合成。
DNA合成仪
2．半合成法
（1）适用对象：全基因或较大基因。采用化学合成成本昂贵，使用半合成法可以降低成本。
（2）合成过程
3′末端具有10～14个互补碱基
模板—引物
Klenow酶
DNA连接酶
（二）从基因文库中获取目的基因
基因文库的种类
基因组文库
部分基因文库
目的基因的获取
基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
将这些载体导入到受体细菌或细胞中，这样每个细胞就包含了一个基因组DNA片段与载体重组DNA分子，经过繁殖扩增，许多细胞一起包含了该生物全部基因组序列，我们将这一个集合体叫做基因文库。
①基因组文库
a.概念：含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
b.构建过程：
c.筛选：一般采用 的方法，将某基因的 作为筛选的探针，在基因组文库中筛选含有目的基因的菌落，进行扩增、分离回收而获得目的基因。
核酸探针杂交
已知片段
目的基因的获取
限制酶
DNA
连接酶
转
染
①建立基因组文库
某生物所有DNA
特定的限制酶
基因组所有基因
每个基因和载体结合重组质粒
导入受体菌
基因组文库
目的基因的获取
②cDNA文库
a.构建：从组织细胞中提取 ， 成cDNA，与适当载体连接后 宿主。
b.概念：包含着某种细胞全部 信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
c.构建合适的cDNA文库已成为获取 目的基因的常用方法。
mRNA
逆转录
转化
mRNA
真核生物
目的基因的获取
②建立cDNA基因文库
某种生物的成熟mRNA
单链DNA
双链DNA片段（cDNA）
导入受体菌中储存
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
与载体连接
目的基因的获取
P67 探究点一　目的基因的获取
　如图，基因在结构上分为编码区和非编码区，非编码区位于编码区的上游和下游，在对基因的表达调控中发挥重要作用(如启动子和终止子)，不编码蛋白质。真核生物基因的编码区一般是不连续的，由外显子和内含子相间排列组成，整个编码区转录的产物为不成熟的mRNA，然后，不成熟的mRNA中的内含子转录的片段被剪切掉，外显子转录的片段拼接起来，形成成熟的mRNA；原核生物基因的编码区是连续的，转录的产物即为成熟的mRNA。
根据以上资料和教材相关内容，分析回答下列问题：
(1)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主构建而成，该基因文库含有该生物的全部基因还是部分基因，为什么？
提示　由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库(cDNA文库)仅含该生物的部分基因。
(2)推测从cDNA文库中获取的人胰岛素基因与从基因组文库中获取的人胰岛素基因，结构上有什么不同？
提示　从cDNA文库中获取的人胰岛素基因不含有启动子、终止子、内含子等结构。从基因组文库中获取的人胰岛素基因结构完整。
(3)将从基因组文库中获取的人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞，能否实现成功表达？为什么？
提示　不能。从基因组文库中获取的人胰岛素基因含有内含子，而大肠杆菌是原核生物，细胞内缺乏剪切内含子转录片段的系统，不能形成成熟的mRNA。
(4)如何构建含有人胰岛素基因的cDNA文库？
提示　从人的胰岛B细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主细菌。宿主细胞群则是含有人胰岛素基因的cDNA文库。
核心归纳-创新设计P68归纳提升
1.目的基因的获取方法
(1)化学合成法
①基因比较小且已知其序列用化学合成法直接人工合成。
②全基因或较大基因使用半合成的方法，可以降低成本，有利于普及采用。
(2)通过基因文库获取目的基因
①基因组文库(含某生物的全部基因)
供体生物→全部DNA→DNA片段→体外重组→受体菌群。
②cDNA文库(含某生物的部分基因)
供体生物→mRNA→cDNA→体外重组→受体菌群。
纯化获得核酸分子
从释放出来的细胞成分中分离核酸分子
裂解细胞使核酸分子释放出来
如何获得上述方法中所需要的基因组DNA或mRNA呢？
3．从细胞中获得基因组DNA或mRNA的基本过程
四
DNA 的粗提取与鉴定
（一）实验原理
1.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
（提取原理）
（提取原理）
物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液
DNA 溶解 析出
蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解
在 条件下，DNA与 发生反应，溶液呈 。
酸性
二苯胺
蓝色
DNA 的粗提取与鉴定
（一）实验原理
DNA
+
二苯胺
沸水浴
蓝色
（鉴定原理）
实验步骤
材料的选取
制备鸡血细胞液
破碎细胞
溶解DNA
析出DNA
获得含有一定杂质的DNA
DNA的鉴定
DNA 的粗提取与鉴定
材料的选取
选用DNA含量相对较高的生物组织（以鸡血为例）。
DNA 的粗提取与鉴定
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
材料的选取
选用DNA含量相对较高的生物组织（以鸡血为例）。
制备鸡血细胞液
取质量浓度为0.1 g·mL-1的柠檬酸钠溶液100 mL和新鲜鸡血180 mL，注人500 mL烧杯中→充分搅拌，混合均匀→4℃冰箱内静置1天，使血细胞沉淀。
DNA 的粗提取与鉴定
思考：为什么要除去上清液，制备鸡血细胞液
上清液是血浆，不含DNA，而鸡血细胞液中的是血细胞，DNA含量丰富。
DNA 的粗提取与鉴定
鸡血细胞液→加蒸馏水→用玻璃棒搅拌→用垫有纱布的漏斗过滤→收集滤液
破碎细胞
蛋白质、多糖、脂质和RNA等物质。
思考：破碎细胞后获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
（二）去除滤液中的杂质
利用 ，通过控制NaCl的浓度去除杂质。
具体做法：在滤液中加NaCl ，使NaCl溶液浓度为 ，过滤除去 ，再调节NaCl溶液浓度为 ，析出 ，过滤去除 ，再用 溶液溶解 。
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
2mol/L
不溶的杂质
0.14mol/L
DNA
溶液中的杂质
2mol/L NaCl
DNA
DNA 的粗提取与鉴定
取物质的量浓度为2 mol·L-1的NaCl溶液40 mL加入滤液中，用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌，使其混合均匀，使滤液中的DNA充分溶解。
溶解DNA
DNA 的粗提取与鉴定
思考：搅拌时应轻缓、并沿一个方向，为什么？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
取适量蒸馏水沿烧杯内壁缓缓加入，同时用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌。随蒸馏水的不断加入，NaCl溶液浓度会降低，DNA的溶解度会降低，烧杯中会有丝（絮）状物出现。当丝状物含量不再增加时，停止加入蒸馏水。也可以在破碎细胞过滤后收集的滤液中，加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，DNA的丝状物会从滤液中析出。
析出DNA
DNA 的粗提取与鉴定
（1）酒精起什么作用？
（2）为什么玻璃棒要沿一个方向搅拌？
DNA不溶于酒精，蛋白质则溶于酒精，可将DNA与蛋白质分离
防止DNA分子断裂，DNA数量少实验现象不明显
①溶解DNA，去除杂质：将分离的丝状物放入物质的量浓度为2 mol·L-1的NaCl溶液中，使其溶解，同时在物质的量浓度为2 mol·L-1NaCl溶液中溶解度低的蛋白质会析出。
②在溶有DNA的溶液中滴加二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液变成蓝色。
DNA的鉴定
DNA 的粗提取与鉴定
不同试剂的作用
试剂 作用
蒸馏水
NaCl溶液
乙醇
二苯胺
柠檬酸钠
加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破
加到含DNA的2 mol·L-1的NaCl溶液中，使其浓度下降析出DNA
2 mol·L-1的NaCl溶液可以溶解DNA
冷却的、体积分数为95%的乙醇可以除去杂质以提纯DNA
鉴定DNA的试剂
抗凝剂，防止血液凝固
0.14 mol·L-1的NaCl溶液可以析出DNA
DNA 的粗提取与鉴定
DNA的粗提取和鉴定实验中的注意事项
(1)过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。
(2)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但细胞破裂时应快速搅拌。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。
(4)在鸡血中加入柠檬酸钠防止血液凝固。
(5)提取含有杂质较少的DNA时，应加入冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，因为DNA不溶于乙醇，细胞中某些蛋白质可溶于乙醇，进一步提纯DNA，且冷却的乙醇可以防止DNA降解，易形成沉淀，增加DNA的柔韧性，减少断裂。
注意说明——创新设计P70
探究点三　DNA的粗提取和鉴定
1.能用猪血作为实验材料提取DNA吗？为什么？
提示　不能。猪属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞不含有细胞核和各种细胞器，不含有DNA。
2.根据DNA粗提取和鉴定的过程及提供的资料，讨论并回答下列问题。
资料1　DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线
资料2　DNA与蛋白质等物质的物理和化学性质有差异，如DNA不溶于乙醇，但某些蛋白质溶于乙醇。
(1)根据资料1回答，在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的作用相同吗？如不相同，分别分析其目的。
提示　实验中两次加入蒸馏水的目的不相同；第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。
(2)根据资料2中DNA和蛋白质在酒精中的溶解度的特点，分析如何将DNA和蛋白质进一步分离？
提示　向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量的、冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的纯化作用。
探究点三　DNA的粗提取和鉴定
02
基因表达载体的构建
基因表达载体构建的目的
(1)使目的基因进入受体细胞并 。
(2)使目的基因能稳定存在且 给后代。
有效表达
遗传
基因表达载体的构建——核心
①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
基因表达载体的构建——核心
质粒
DNA分子
一个切口
两个黏性末端
两个切口
获得目的基因
DNA 连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同种 限制酶
目的基因与运载体的结合过程，
实际上是不同来源的基因重组的过程。
基因表达载体的构建——核心
基因表达载体除含有目的基因外，还必须有复制原点、启动子、终止子、标记基因等。
（1）本质：有特殊序列结构的DNA片段
（2）位置：目的基因的上游
（3）功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因开始转录，进而合成出相应的mRNA
基因表达载体的构建——核心
①目的基因：
控制特定性状或表达特定产物。
②启动子：
（1）本质：有特殊序列结构的DNA片段
（2）位置：目的基因的下游
（3）功能：使转录在需要的地方终止
初步筛选出接受了目的基因的受体细胞。常用的标记基因有抗性基因（如抗生素抗性基因）或某些生化标记基因
基因表达载体的构建——核心
③终止子：
④标记基因：
⑤复制原点：
要能与特定的受体细胞相匹配使外源基因在受体细胞中能稳定复制并遗传
问题:目的基因该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
基因表达载体的构建——核心
DNA连接酶
同一种限制酶切（单酶切）
单酶切缺点:
质粒重新环化
目的基因自身环化
质粒与目的基因反向连接(后果)
同两种限制酶切（双酶切）
能避免反向连接
双酶切的优点:
防止质粒重新环化
防止质粒与目的基因反向连接
防止目的基因自身环化
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学成分 位置
作用
DNA片段
mRNA上三个相邻的核糖核苷酸
目的基因上游
目的基因下游
mRNA的首端
mRNA的尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位
决定转录的终止
翻译的起始信号
决定翻译过程的终止
基因表达载体的构建——核心
核心探讨——创新设计P67教材边角
1.结合基因表达载体模式图分析以下问题：
(1)图中a、b、c分别代表什么结构？
a为启动子、b为终止子、c为复制原点。
(2)启动子和终止子与起始密码子和终止密码子是一回事吗？
不是一回事，启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分。而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
(3)为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？
启动子位于目的基因的首端使转录开始，是RNA聚合酶识别、结合的部位；终止子位于目的基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。
探究点二　基因表达载体的构建
目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。
(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为______________________。
(2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因是____________________________________________________________。
(3)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA，但会导致________
__________________________________________等问题，为避免以上问题出现，应使用______________________________________________________两种限制酶。
(4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上________，其是______________识别和结合的部位。
限制酶和DNA连接酶
SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因
目的基
因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接
BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和Hind Ⅲ)或EcoRⅠ和BamH Ⅰ
启动子
RNA聚合酶
探究点二　基因表达载体的构建
(5)请简要描述基因表达载体的构建过程。
提示　用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段，产生末端相同的切口，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。(如图)
探究点二　基因表达载体的构建
核心归纳
1.如何选择限制酶
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)切割。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具有标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。
(3)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达，即酶切位点应位于启动子与终止子之间。
核心归纳

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