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(共55张PPT)
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
PCR扩增仪
基因
表达载体
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术所需的三种基本工具：
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
载体
学习目标
1.运用归纳与概括、模型与建模等方法,分析基因工程操作的四个步骤。
2.通过对基因工程案例的分析,理解基因工程基本操作程序的常用方法和基本原理。
3.尝试用PCR技术扩增目的基因,并通过琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR产物。
苏云金杆菌
Bt抗虫蛋白基因
普通棉花（不抗虫）
棉花细胞
（含Bt抗虫基因）
抗虫棉
提取
导入
与载体拼接
Bt基因表达
基因工程培育抗虫棉的思路：
一、目的基因的筛选与获取
二、基因表达载体的构建
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
前提
核心
关键
保证
01
基因工程的基本操作程序
一、
目的基因的筛选与获取
(1)概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
与生物药物相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
(2)实例：
根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。
目的基因
1．筛选合适的目的基因
(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
(2)实例：
Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程
苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）,破坏昆虫的消化系统来杀死棉铃虫
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
一
目的基因的筛选和获取
随着测序技术的发展，以及序列数据库、序列比对工具等的应用，越来越多的基因的 为人们所知。
结构和功能
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
明确了目的基因后，该如何获得它？
DNA合成仪
一
目的基因的筛选和获取
获取目的基因的方法：
①从基因文库中获取
②人工合成
前提：
方法：
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
2．目的基因的获取
获取一个目的基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？
先对目的基因进行扩增
2、DNA复制的特点:
①边解旋边复制
①模板：
②原料：
③能量:
④酶 ：
亲代DNA的两条链
4种游离的脱氧核苷酸
解旋酶，DNA聚合酶等
1、DNA复制的条件
ATP
②半保留复制
知识回顾
体内DNA复制
②合成子链（DNA聚合酶）
以每一条母链为模板，以游离的将4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，在DNA聚合酶的作用下合成与母链互补的1条子链。
3.过程：
①解旋（解旋酶）
知识回顾
体内DNA复制
▲子链的合成方向：5'端→3'端
因为DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。
DNA的复制视频讲解
02
目的基因的筛选与获取
【自主学习·合作探究】5min阅读P77—79相关内容，思考讨论：
1.PCR的全称、操作环境、原理、目的、基本组分和条件以及各条件的作用是什么？
2.PCR的反应过程是如何进行的？
PCR与DNA的体内复制是否完全相同？
PCR技术：
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
一.目的基因的筛选与获取---利用PCR获取和扩增目的基因
原理
操作环境
目的
优点：
PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR技术
耐高温的DNA聚合酶
DNA模板
引物
缓冲溶液
四种脱氧核苷酸
PCR扩增仪（PCR仪）
条件:
微量离心管
——控制温度
（2种）
一般添加Mg2+
（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）
引物（2种）
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
3’
5’
DNA母链
▲子链的合成方向：5'端→3'端
引物：
1.有 种引物，且只能结合在DNA母链的3’端
2.作为复制的起始点，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
2
引物（2种）
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
▲子链的合成方向：5'端→3'端
引物：
1.有 种引物，且只能结合在DNA母链的3’端
2.作为复制的起始点，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
2
引物（2种）
PCR反应过程
待扩增的DNA片段
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
变性
3’
5’
3’
5’
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
复性
延伸
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，
经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮循环的产物
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
注意：DNA聚合酶可重复使用，引物需不断加入
第一轮循环的产物
受热变性
引物
耐高温的
DNA聚合酶
(1)过程：
（2）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR循环，以_____方式扩增，
可以扩增出 个DNA片段。　　　　
指数
2n
PCR小结
琼脂糖凝胶电泳
（3）鉴定：完成后，常采用 来鉴定PCR的产物。　
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 场所
解旋方式
酶
特点
引物
结果
共同点 PCR技术 vs DNA复制
主要在细胞核内
解旋酶催化
体外(主要在PCR扩增仪内)
DNA在高温下变性解旋
解旋酶、DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶
一小段单链DNA
一小段RNA
扩增特定的DNA片段
都需要：模板、4种脱氧核苷酸、酶、引物
半保留复制、边解旋边复制
半保留复制、全解旋再复制
形成完整的DNA分子
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成DNA再进行扩增。
单链RNA
逆转录酶
杂交双链
DNA链
RNA链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA(cDNA)
PCR扩增
思考
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成DNA再进行扩增。
单链RNA
逆转录
双链DNA(cDNA)
PCR扩增
思考
（1）引物是一小段能与 DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，通常为20-30个核苷酸。
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。
引物与目的基因模板链的 端结合。
从子链的5′端向3′端延伸
3′
【拓展练习】
①全称：
②操作环境：
③原理：
④前提：
⑤条件：
⑥过程：
⑦优点：
聚合酶链式反应
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
可以在短时间内大量扩增目的基因（以指数形式扩增）
DNA半保留复制
已知目的基因两端的核苷酸序列（为了合成2种引物）
（模板DNA、4种游离脱氧核苷酸、引物（2种）、耐高温的DNA聚合酶）
变性：
复性：
延伸：
DNA解链（超过90℃）
引物结合到DNA模板链（50℃左右）
DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成（72℃左右）
模板、原料、引物、酶
总结：PCR技术
6.下列属于PCR技术所需条件的是（ ）
①单链的核苷酸序列引物　 ②目的基因所在的DNA片段 ③脱氧核苷酸
④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　⑥耐高温的DNA聚合酶　⑦限制酶
A.①②③⑤ B.①②③⑥ C.①②③⑥⑦ D.①②③⑤⑥
B
5.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关
PCR的叙述，错误的是（ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解旋不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶和4种核糖核苷酸
D
1.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。 ( )
2.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 ( )
3.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。 ( )
4.PCR中，模板链上碱基G和C的比例越高，DNA 变性解链的温度越高（ ）
X
X
√
√
获得目的基因后直接转入受体吗？
思考
不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
问题思考
基因工程第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体的构建
二
——核心步骤
启动子：
位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段
(RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录)
终止子：
位于基因下游的一段有特殊序列的DNA片段
(终止转录)
1.目的
2.组成
标记基因：
目的基因：
复制原点：
鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞
目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
DNA复制的起始位点。
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
基因表达载体的构建
二
——核心步骤
1.目的
2.组成
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
载体≠表达载体的区别：
表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
基因表达载体的构建
二
——核心步骤
基因表达载体中启动子、终止子的来源：
①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的:已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。
②如果目的基因是通过人工方法合成的:
则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
重组DNA分子
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
DNA连接酶
基因表达载体构建模式图
限制酶
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
质粒
同种限制酶
或能产生相同末端的限制酶
？
基因表达载体的构建
二
——核心步骤
3.过程
难点剖析
1.目的基因应该插入到载体的哪个部位？如果目的基因插入到标记基因或复制原点中，该基因表达载体还能用么？如何避免这种现象？
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，才能保证目的基因的正常转录。
（2）目的基因、启动子、终止子、复制原点等各个结构都不得含有限制酶识别序列，否则会影响表达载体的构建。
培育抗虫棉的简要过程
质粒
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何解决这一问题？
难点剖析
2.使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与质粒结合的这一种重组DNA？
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
目的基因
反向连接
2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的随意连接？
双酶切
难点剖析
如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因内部不含图中限制酶识别序列，为使该基因与该质粒构建重组质粒，切割目的基因和质粒时应该选择哪两种酶？
A、NdeⅠ和BamHⅠ
B、NdeⅠ和XbaⅠ
C、XbaⅠ和BamHⅠ
D、EcoRⅠ和KpnⅠ
课堂练习
A
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间。
（2） 限制酶切割时不能破坏启动子、终止子、复制原点等结构。
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
问题思考
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
三、
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入微生物细胞
培育抗虫棉的简要过程
1.花粉管通道法（我国独创）
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入植物细胞
2.农杆菌转化法
农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒
当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的植物细胞，并且将其整合到该植物细胞的染色体DNA上
农杆菌
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
表现出新性状的植株
导入植物细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
Ti质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
转化过程示意图：
植物组织培养技术
2.农杆菌转化法
目的基因
Ti质粒上的T-DNA可以整合到受体细胞的染色体DNA上
该过程经过_______次拼接、_______次导入？
(1)第一次拼接：__________________________________________________
第二次拼接：__________________________________________________
(2)第一次导入：__________________________________________________
第二次导入：___________________________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞
2.农杆菌转化法
培育抗虫棉的简要过程
显微注射法
将目的基因导入动物细胞
提纯含目的基因表达载体
受精卵
显微注射
胚胎移植
发育
新性状动物
体外培养
①体积大，易操作。
②全能性高，易培养成完整个体。
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
操作程序：
原理：使用Ca2+处理可使受体细胞处于一种能吸收周围
环境中DNA分子的生理状态。（感受态细胞）
过程
原核生物（大肠杆菌）作为受体细胞有哪些优点：
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
Ca2+处理细胞
感受态细胞
将重组好的表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
大肠杆菌细胞
Ca2+处理法
将目的基因导入微生物细胞
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
Ca2+处理法
课堂总结
显微注射法(以受精卵作为受体细胞)
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
问题思考
基因工程第四步：目的基因的检测与鉴定
1.分子水平检测
2.个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
4
目的基因的检测与鉴定
在转基因生物的培育过程中，可以从哪些层次对目的基因进行检测与鉴定？
1、检测转基因生物是否插入了目的基因
方法：PCR技术、DNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同DNA片段，并用同位素进行标记（基因探针）
2.提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。
3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA。
转基因生物
的DNA
目的基因
15N
变性
变性
15N
杂交DNA分子
（基因探针）
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,
表明目的基因转录出了mRNA。
方法：PCR技术、分子杂交技术
变性
基因探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：
抗原与抗体的特异性结合
原理：
检测过程：
抗原— 抗体杂交技术
通常以目的基因的表达产物(蛋白质)作抗原,制备相应抗体,利用抗原与抗体特异性结合的原理检测。
提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒植物
抗盐植物
抗除草剂植物
植物叶片饲喂害虫
（抗虫接种实验）
害虫死亡
用盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
个体水平鉴定
目的基因的检测与鉴定
用该病毒去感染植物
植物未染病
类型 检测内容 方法
分子水平检测
个体水平鉴定 总结:
转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出mRNA
目的基因是否翻译形成蛋白质
PCR技术、
DNA分子杂交技术
PCR技术、
分子杂交技术
抗原-抗体杂交技术
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
4
目的基因的检测与鉴定
2.下列关于基因工程的叙述，正确的是( )
A.DNA连接酶能使两碱基间形成氢键连接起来
B.质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体
C.限制性酶能够特异性识别并切烟草花叶病毒遗传物质
D.农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组，然后将重组DNA分子导入植物受体细胞
1.下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是( )
A.具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增
B.具有启动子，作为肽链合成的起始信号
C.具有标记基因，有利于目的基因的初步检测
D.具有目的基因，以获得特定的基因表达产物
3.土壤农杆菌侵染植物细胞时，其Ti质粒上的T-DNA片段可转入植物的基因组中。利用农杆菌的Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是( )
A.目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏TDNA
B.用Ca2+处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C.Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D.T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物细胞的染色体上
4.基因工程为植物育种提供了技术保障。如图为植物育种的过程(字母代表相应的物质或结构,数字代表过程或方法)。下列说法正确的是
A①过程需要的酶有限制酶和DNA聚合酶
B.②过程常用的方法是农杆菌转化法
C.③④过程为脱分化和再分化,该过程没有体现植物细胞的全能性
D.转基因生物DNA上是否插人目的基因，可用抗原-抗体杂交技术检测
目的基因
愈伤组织
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
课堂练习
将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。

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