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(共58张PPT)
3.1 重组DNA技术的基本工具
1.基因是什么？
2.基因的功能是什么？
基因通过控制蛋白质的合成，直接或间接控制生物的性状。
转录
DNA
mRNA
蛋白质
翻译
——体现相关的生物性状
知识回顾——基因
基因是有遗传效应的DNA片段。
基因是控制生物性状的基本单位
①DNA中文全称:　　　　　　　
②组成元素:　　　　　　　　
③基本单位:　　　　　　　　　
脱氧核糖核酸
C H O N P
脱氧核糖核苷酸
= 磷酸 + 脱氧核糖 + 含氮碱基
脱氧
核糖
含氮碱基
磷酸
1′
4′
3′
2′
5′
A T C G
脱氧核苷酸
(4种)
知识回顾——DNA
胞嘧啶脱氧核苷酸
鸟嘌呤脱氧核苷酸
胸腺嘧啶脱氧核苷酸
腺嘌呤脱氧核苷酸
脱氧
核糖
A
磷酸
脱氧
核糖
G
磷酸
脱氧
核糖
T
磷酸
T
磷酸
脱氧
核糖
C
磷酸
脱氧
核糖
A
磷酸
脱氧
核糖
磷酸二酯键
脱氧核苷酸如何连接成脱氧核苷酸链的呢？
知识回顾——DNA
氢键
双螺旋结构
知识回顾——DNA
DNA的结构特点：
5’
3’
3’
5’
知识回顾——DNA
② 和 交替连接，排列在外侧，构成 ； 排列在内侧。
③两条链上的碱基通过 连接成碱基对，且遵循 。
①DNA是由两条单链组成的，这两条链
按 方式盘旋成双螺旋结构。
反向平行
脱氧核糖
磷酸
碱基
基本骨架
氢键
碱基互补配对原则
…… ATGCCGTGGAATTCC ……
…… TACGGCACCTTAAGG ……
①
②
①磷酸二酯键
②氢键
简图：
知识回顾——DNA
基因工程的诞生和发展
①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了遗传物质是________，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
②1953年，沃森和克里克建立了___________________模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
③20世纪70年代初，多种限制酶、____________酶和逆转录酶被相继发现，为DNA的切割、连接创造了条件。
④1973年，科学家证明________可以作为基因工程的载体，构建___________，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。
⑤1985年，穆里斯等人发明______，为获取目的基因提供了有效手段。
DNA
DNA双螺旋结构
DNA连接
质粒
重组DNA
PCR
基因工程
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
操作结果
操作水平
原理：
优点：
基因重组
定向改造生物体的性状
别名
遗传信息的传递都遵循中心法则。
生物界共用一套遗传密码。
1.简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
2.说出基因工程中作为载体需要具备的条件。
4.进行DNA的粗提取与鉴定
3.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
学习目标
1.简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
2.说出基因工程中作为载体需要具备的条件。
4.进行DNA的粗提取与鉴定
3.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
学习目标
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
普通棉花
如何能培育出自身就能抵抗虫害 的棉花新品种呢？
转基因抗虫棉
已知：苏云金芽孢杆菌含有一种抗虫基因。
普通棉花(无抗虫特性)
抗虫基因
剪下来的抗虫基因能否直接把它导入到棉花体内？
不能。大多数生物会排斥外来的基因，若直接导入会被降解。
普通棉花(无抗虫特性)
“分子缝合针”
“分子运输车”
抗虫基因
与载体DNA拼接，再导入
“分子缝合针”
“分子运输车”
抗虫基因
与载体DNA拼接，再导入
抗虫棉
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术所需的三种基本工具：
1、来源：
主要从原核生物中分离纯化出来
2、种类：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制酶。
3、作用特点：
具有专一性
4、作用部位:
特定位点上的磷酸二酯键
①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。
②能够切割特定序列中的特定位点。
一
“分子手术刀”——
限制性内切核酸酶
（简称限制酶）
限制酶不是一种酶，而是一类酶
限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
举例1：EcoRⅠ
专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间的磷酸二酯键断开。
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
黏性末端　　　　
黏性末端　　　　
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
举例2：SmaⅠ
能识别CCCGGG序列，并使C和G之间的磷酸二酯键断开。
平末端
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
4.切割结果：
EcoR Ⅰ
中轴线
黏性末端
平末端
Sam Ⅰ
产生黏性末端或平末端
5.限制酶的识别序列的特点：
读：5’→ 3’
(1)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
（一条链正向读的碱基顺序与另一条链逆向读的顺序完全一致）。
(2)能被限制性酶特异性识别的序列一般都是回文序列：在限制酶所识别的序列作中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称排列的。
下列哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A. GAATTC
CTTAAG
B. GGGGCCCC
CCCCGGGG
C. CTGCAG
GACGTC
D. GTAAATC
CATTTAG
1.写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考以下问题：
同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
总结：
1.大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
（一条链正向读的碱基顺序与另一条链逆向读的顺序完全一致）。
2.能被限制性酶特异性识别的序列一般都是回文序列：在限制酶所识别的序列作中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称排列的。
3.同种限制酶切割产生的黏性末端相同，
不同限制酶切割产生的黏性末端可能相同。
资料卡
限制酶名字的由来
限制酶是如何、命名的呢？是用生物署名的头一个字母词与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如，一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
EcoRⅠ
种加词头两个字母
菌株型号
数字表示 分离出来的第几种限制酶
属名首字母
大肠杆菌（Escherichia coli） R型菌株分离出来的第一种限制酶
【问题探究1】限制酶主要从原核生物中分离得到的，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
【问题探究2】原核生物中的限制酶会不会切割本身的DNA分子？
含某种限制酶的原核生物的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，
或者该识别序列的碱基已经被修饰(甲基化)，使限制酶不能将其切开。
【问题探究3】请结合下图，推断限制酶切一次可断开几个磷酸二酯键？
消耗几分子水？产生几个黏性末端？
断开两个磷酸二酯键；消耗两分子水；产生2个黏性末端。
黏性末端　　　　
黏性末端　　　　
【问题探究4】要想从一个DNA分子中获得某个特定的基因需要用限制酶切几次？
CT TCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGAT T
GGCATCTTAA
AAT TCCGTAG
1. 作用：
将DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
“分子缝合针”——
二
DNA连接酶
两个DNA片段要具有相同的黏性末端才能拼接起来
能否连接任意的DNA片段？
2、DNA连接酶的缝合作用
抗虫基因
为了确保切割后的两个DNA片段能够拼接，一般是用同种限制酶进行切割
（因为同种限制酶切割产生的黏性末端一样）
若用不同限制酶切割，需确保切割后产生的黏性末端一样
基因工程
①E.coli DNA连接酶
②T4 DNA连接酶
从大肠杆菌分离得到
只能连接互补黏性末端的DNA片段
从T4噬菌体分离得到
黏性末端和平末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。
平末端
黏性末端
3. DNA连接酶的种类：
DNA聚合酶
解旋酶
DNA的复制
基因工程
比较限制酶、DNA连接酶、解旋酶、DNA聚合酶
【知识扩展】
解旋酶:
作用于氢键，使DNA的两条链解开
DNA聚合酶：
作用于磷酸二酯键，将游离的脱氧核苷酸连接起来，需要模板
限制酶:
作用于磷酸二酯键，将DNA切成两个片段
DNA连接酶：
作用于磷酸二酯键，将两个DNA片段连接为一个DNA分子
写出对应的酶
限制酶
DNA连接酶
解旋酶
DNA聚合酶
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
作用：
种类：
将目的基因送入受体细胞，使目的基因在受体细胞内进行大量复制
通常是用质粒、噬菌体、动植物病毒也可以。
三
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
三
注：
1.常见的标记基因：四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等
2.真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
运载体需具备的条件：
①有一个至多个限制酶切割位点
（供外源DNA片段（基因）插入其中）
②携带外源DNA片段进入受体细胞后，能进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
（使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制）
③具有特殊的标记基因
（便于重组DNA分子的筛选）
对受体细胞无害
三
质粒的结构模式图
标记基因：便于重组DNA分子的筛选
原理如下图所示：
含有氨苄青霉素抗性基因的质粒
导入受体细胞
在含有 的选择培养基上培养
氨苄青霉素
1.“分子手术刀”——
来源：
作用：
作用结果：
2.“分子缝合线”——
作用：
分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
小结：基因工程的基本工具
【反馈练习】
1.下列关于质粒的叙述，正确的是（ ）
A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B.质粒是细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子
C.基因工程使用的载体只有质粒
D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞内独立进行
B
2．（多选）下列有关限制性内切核酸酶的叙述，错误的是（ ）
A．用限制酶切割一个目的基因两端时，被水解的磷酸二酯键有2个
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C．5′—↓ CATG—3′和5′—G↓CATGC—3′序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接
D．只有用相同的限制酶处理含有目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
AD
4.（高考全国卷I）已知在一线性DNA分子上有3个某种限制酶的切割位点,如下图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该限制酶切断,则会产生a、b、c、d 4种不同长度的DNA片段。
现有多个上述线性DNA分子,若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断,则从理论上讲,经该限制酶切开后,这些线性DNA分子最多能产生的长度不同的DNA片段种类数是(　　)
A.3种 B.4种 C.9种 D.12种 E.19种
线性DNA分子的酶切示意图
切断1个酶切位点
切断2个酶切位点
切断3个酶切位点
① ② ③
下面是4种限制酶所识别的DNA分子序列和切割位点图(↓表示切割位点,切口为黏性末端),下列叙述正确的是(　　)
限制酶1:
限制酶2:
限制酶3:
限制酶4:
A.限制酶1和3切出的黏性末端相同
B.限制酶1、2、4识别的序列都由4个脱氧核苷酸组成
C.在使用限制酶的同时还需要解旋酶
D.限制酶1和2切出的DNA片段可通过T4 DNA 连接酶拼接
DNA粗提取与鉴定
1.提取DNA的基本思路
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2.实验原理
溶解度
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，可提纯DNA。
①DNA不溶于酒精，细胞中某些蛋白质溶于酒精，用于初步分离DNA。
当NaCl的物质的浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度 。此时DNA （溶解或析出）。当NaCl的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大。
利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。
最小
析出
一
DNA粗提取与鉴定
3、DNA的鉴定
DNA + 二苯胺 蓝色
沸水浴
二苯胺有毒，现配现用并用棕色瓶保存。
一
DNA粗提取与鉴定
材 料
1、生物材料：
2、试剂及作用:
有DNA的生物均行！
研磨液：
体积分数为95%的酒精：
2mol/L 的NaCl 溶液：
二苯胺试剂：
析出DNA（即粗提取DNA）。
溶解DNA
鉴定DNA
破坏细胞，释放出细胞内的物质。
新鲜洋葱或香蕉、菠菜、菜花、猪肝等
一
DNA粗提取与鉴定
过 程
选材、研磨
去除杂质
DNA的析出
DNA的鉴定
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
洋葱
研磨液
在漏斗中垫上纱布，过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的 溶液,静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
上清液
上清液
预冷的95%酒精
白色丝状物
加入2mol/L氯化钠溶液
加入4ml二苯胺试剂
不加入丝状物
5.DNA的析出与鉴定
DNA
+
二苯胺
沸水浴
蓝色
实验组
对照组
水浴加热
加入2mol/L氯化钠溶液
加入4ml二苯胺试剂
加入丝状物
DNA的粗提取与鉴定
5
思考. 讨论
（1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
（2）猪和鸡的成熟红细胞，是否适合用作提取DNA的材料？
（3）如果用动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
提示：猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合；
提示：选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
提示：充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA
加入清水，使细胞吸水膨胀，裂解释放DNA。
一
DNA粗提取与鉴定
材 料
2、试剂及作用:
研磨液：
体积分数为95%的酒精：
2mol/L 的NaCl 溶液：
二苯胺试剂：
析出DNA（即粗提取DNA）。
溶解DNA
鉴定DNA
破坏细胞，释放出细胞内的物质。
4.（高考全国卷I）已知在一线性DNA分子上有3个某种限制酶的切割位点,如下图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该限制酶切断,则会产生a、b、c、d 4种不同长度的DNA片段。
现有多个上述线性DNA分子,若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断,则从理论上讲,经该限制酶切开后,这些线性DNA分子最多能产生的长度不同的DNA片段种类数是(　　)
A.3种 B.4种 C.9种 D.12种 E.19种
线性DNA分子的酶切示意图
切断1个酶切位点
切断2个酶切位点
切断3个酶切位点
① ② ③
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
3.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏__________和_____________。
（2）在基因工程的操作中， （能/不能）选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后，_______________________________________。
目的基因
标记基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。
方法总结：---选择酶切位点的原则
1、 选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中添加
抗生素B，则应该选择的限制酶
为_______。
（2）在培养细菌的培养基中添加
抗生素A，则应该选择的限制酶
为_____。
①或②
①
学以致用

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