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03
第三步：将目的基因导入受体细胞
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
我国科学家独创
常用
显微注射法
Ca2+处理法
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
植物细胞
花粉管通道法
方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
（我国科学家独创）
（我国科学家独创）
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
植物细胞
花粉管通道法
方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
植物细胞
花粉管通道法
农杆菌转化法
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
农杆菌
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
植物细胞
花粉管通道法
农杆菌转化法
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
农杆菌
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
农杆菌
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
目的基因
构建表达载体
含目的基因的
重组 Ti 质粒
转入农杆菌
含重组 Ti 质粒的农杆菌
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
农杆菌
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
目的基因
构建表达载体
含目的基因的
重组 Ti 质粒
转入农杆菌
含重组 Ti 质粒的农杆菌
导入植物细胞
将目的基因插入
染色体 DNA 中
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
农杆菌
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
目的基因
构建表达载体
含目的基因的
重组 Ti 质粒
转入农杆菌
含重组 Ti 质粒的农杆菌
导入植物细胞
将目的基因插入
染色体 DNA 中
表现出新性状的植株
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
农杆菌
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
目的基因
构建表达载体
含目的基因的
重组 Ti 质粒
转入农杆菌
含重组 Ti 质粒的农杆菌
导入植物细胞
将目的基因插入
染色体 DNA 中
第一次拼接
第二次拼接
第一次导入
第二次导入
该过程涉及两次拼接和两次导入，你能总结吗？
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）。
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。
方法一：可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
受体细胞为受精卵
受体细胞为体细胞
（利用植物细胞的全能性）
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
农杆菌转化法小结
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
我国科学家独创
常用
显微注射法
Ca2+处理法
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
我国科学家独创
常用
显微注射法
Ca2+处理法
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
动物细胞
显微注射法
将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
动物细胞
显微注射法
将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。
受精卵
注射器
固定吸管
显微注射仪
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
我国科学家独创
常用
显微注射法
Ca2+处理法
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
我国科学家独创
常用
显微注射法
Ca2+处理法
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
微生物细胞
Ca2+处理法
在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。
研究人员一般先用Ca 2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
Ca2+
感受态细胞
吸收
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
04
第四步：目的基因的检测与鉴定
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
（一）分子水平检测
（二）个体生物学水平鉴定
方法：
抗虫或抗病接种实验
PCR等技术
——“抗原—抗体杂交技术”
之前我们使用过标记基因检测目的基因是否插入，还记得吗？
(4)β-半乳糖苷酶可分解无色的X-gal并产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆菌与基因表达载体混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加_____________________的培养基上培养，待长出菌落后，应挑选___________的菌落作为工程菌生产人胰岛素。
氨苄青霉素和X-gal
白色
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
目的基因插入位点
(4)β-半乳糖苷酶可分解无色的X-gal并产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆菌与基因表达载体混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加_____________________的培养基上培养，待长出菌落后，应挑选___________的菌落作为工程菌生产人胰岛素。
氨苄青霉素和X-gal
白色
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
目的基因插入位点
导入重组质粒
导入原质粒
导入目的基因
未导入成功
在加入氨苄青霉素和X-gal 的培养基中
白色活菌
蓝色活菌
死亡
死亡
白色
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
（一）分子水平检测
（二）个体生物学水平鉴定
方法：
抗虫或抗病接种实验
PCR等技术
——“抗原—抗体杂交技术”
PCR和核酸分子杂交技术可更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因！
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
（一）分子水平检测
（二）个体生物学水平鉴定
方法：
抗虫或抗病接种实验
PCR等技术
——“抗原—抗体杂交技术”
PCR和核酸分子杂交技术可更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因！
方法1：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
根据目的基因的序列设计PCR引物
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳
DNA测序技术
你知道PCR会扩增出哪些不同的片段吗？什么是电泳？
目的基因在整个DNA片段的中央位置
复制3次后
只含目的基因片段
目的基因在整个DNA片段的中央位置
复制3次后
只含目的基因片段
目的基因在整个DNA片段的中央位置
复制3次后
这两个DNA分子量相同吗？
种类1
种类2
种类3
种类4
种类5
目的基因不在整个DNA片段的中央位置
复制3次后
只含目的基因片段
目的基因不在整个DNA片段的中央位置
复制3次后
种类1
种类2
种类3
种类4
种类5
怎么知道里面有该DNA片段？
电泳！
电泳：
在电场的作用下，DNA、RNA、蛋白质等这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
正极
负极
电场力
电泳：
在电场的作用下，DNA、RNA、蛋白质等这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
正极
负极
电场力
电泳：
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。
正极
负极
电场力
电泳常用缓冲液pH8.0～8.3
DNA分子在此pH条件下带负电荷
若此时电场里没有任何障碍物，所有DNA片段会以同样的速度向正极移动，怎么让它们移动速度不相同呢？
电泳：
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。
正极
负极
电场力
电泳常用缓冲液pH8.0～8.3
DNA分子在此pH条件下带负电荷
若此时电场里没有任何障碍物，所有DNA片段会以同样的速度向正极移动，怎么让它们移动速度不相同呢？
琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62 65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。
电泳：
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。
正极
负极
电场力
电泳常用缓冲液pH8.0～8.3
DNA分子在此pH条件下带负电荷
若此时电场里没有任何障碍物，所有DNA片段会以同样的速度向正极移动，怎么让它们移动速度不相同呢？
琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62 65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。
电泳：
正极
负极
电场力
琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62 65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。
加样孔
（加入待测DNA样本）
电泳：
正极
负极
电场力
琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62 65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。
片段短，迁移速率快
片段长，迁移速率慢
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关
凝胶的浓度越大，迁移速率越慢
DNA分子越大，迁移速率越慢
DNA分子构像有环状、链状等
怎么知道这些DNA片段的大小呢？
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
（一）分子水平检测
（二）个体生物学水平鉴定
方法：
抗虫或抗病接种实验
PCR等技术
——“抗原—抗体杂交技术”
方法1：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
根据目的基因的序列设计PCR引物
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳
DNA测序技术
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
（一）分子水平检测
（二）个体生物学水平鉴定
方法：
抗虫或抗病接种实验
PCR等技术
——“抗原—抗体杂交技术”
方法2：
DNA分子杂交技术
提取DNA
样本
基因组DNA
酶切
DNA片段
电泳
目标
片段
（事先不知道）
转膜
硝酸纤维素膜
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
基因探针
是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。
基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。
硝酸纤维素膜
含目的基因的DNA片段
基因探针
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
基因探针
是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。
基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。
硝酸纤维素膜
含目的基因的DNA片段
洗去未结合的探针
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
基因探针
是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。
基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。
硝酸纤维素膜
含目的基因的DNA片段
洗去未结合的探针
显影装置
出现杂交带
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
（一）分子水平检测
方法2：
DNA分子杂交技术
提取DNA
样本
基因组DNA
酶切
DNA片段
电泳
目标
片段
（事先不知道）
转膜
硝酸纤维素膜
待整理：荧光标记的探针
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
②检测目的基因是否转录出了mRNA
（一）分子水平检测
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
方法1：PCR扩增
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
②检测目的基因是否转录出了mRNA
（一）分子水平检测
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
方法1：PCR扩增
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
提取RNA
转基因生物
标记的基因探针
方法2：分子杂交技术
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
③检测目的基因是否翻译出相应蛋白质
（一）分子水平检测
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
方法：
抗原— 抗体杂交
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
抗原与抗体的特异性结合
原理：
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
③检测目的基因是否翻译出相应蛋白质
（一）分子水平检测
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
方法：
抗原— 抗体杂交
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
转基因生物
放射性检测
（杂交带）
抗原与抗体的特异性结合
原理：
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
（二）个体生物学水平鉴定
目的基因是否表现出相应的性状
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
功能、活性正常
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
四
第四步：目的基因的检测与鉴定
（二）个体生物学水平鉴定
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
小结
05
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
（一）实验原理
（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
（一）实验原理
2.DNA片段电泳鉴定的原理：
（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
（二）目的要求
1．了解PCR和电泳鉴定的基本原理。
2．尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
（三）材料用具
PCR的材料用具和步骤
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
PCR仪
（自动控温，实现DNA的扩增）
微量离心管
（实际上是进行PCR反应的场所）
调节旋钮
推动杆
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
一次性吸液枪头
微量移液器
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
(4)一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
(5)电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
(6)4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板
DNA、扩增缓冲液、无菌水。
(7)电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、
琼脂糖和核酸染料等。
PCR仪
（自动控温，实现DNA的扩增）
微量离心管
（实际上是进行PCR反应的场所）
微量移液器
（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
离心机
（使反应液集中在管的底部）
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
（四）PCR步骤
1、移液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
PCR步骤
1、移液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
2、离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
PCR步骤
2、离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
3、反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
电泳的材料用具和步骤
电泳仪
电泳槽
梳子
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
（五）电泳步骤
1、配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
（五）电泳步骤
2、制备凝胶
（1）将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
（3）将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
（2）待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
(电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷)
(梳子孔为加样孔，加样孔侧连电极负极)
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
（五）电泳步骤
2、制备凝胶
（1）将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
（3）将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
（2）待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
（五）电泳步骤
3、加样
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
4、电泳：
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
（五）电泳步骤
3、加样
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
4、电泳：
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
（五）电泳步骤
5、观察记录
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
（六）注意事项
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
五
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
（七）结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
1. 在实际种植过程中，棉铃虫是否对转济基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
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2. 科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对，他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
(1)基因策略。最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如 CrylAa和 CryIAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。
(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
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一、概念检测
练习与应用
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ）
（2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
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