资源简介

(共16张PPT)
基因工程中
限制酶的选择
1．定义
1970年，阿尔伯（W. Arber)、内森斯（D. Nathans)，史密斯（H . C. Smith)在细菌中发现了第一个限制性内切酶（简称限制酶）后，20世纪70年代初相继发现了多种限制酶和连接酶，以及逆转录酶，这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
2．来源
主要从原核生物中分离纯化出来的
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶
3．作用特点
（1）能够专一性识别双链DNA分子的特定核苷酸序列；
一般由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
（2）使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
EcoR I 限制酶
5 GAATTC3
EcoR I
(在G与A之间切割)
Sma I
(在G与C之间切割)
5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
黏性末端
平末端
4．作用结果
（1）黏性末端
限制酶在它识别序列的中心轴线两侧，将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是粘性末端。
经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，黏性末端和平末端。
5 AATT 3
（2）平末端
限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
(1)不破坏目的基因原则：酶切位点位于目的基因的两端，应选择切点位于启动子、终止子之间的酶。如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
5．图解限制酶的选择原则
注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。
A.NdeⅠ和BamHⅠ B.NdeⅠ和XbaⅠ
C.XbaⅠ和BamHⅠ D.EcoRⅠ和KpnⅠ
A
典型例题
1.如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列( )
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
质粒A中没有标记基因，质粒B的复制原点中含有Hind Ⅲ酶切位点
BamHⅠ和HindⅢ
2
不含有
质粒A中没有标记基因，质粒B的复制原点中含有Hind Ⅲ酶切位点
BamHⅠ和HindⅢ
2
不含有
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
①先用NdeI和XhoI酶切质粒2和空载体，将两种酶切产物连接获得连接产物。
②用NcoI和MseI酶切质粒1，用Ncol和Ndel酶上一步中的连接产物，将两种酶切产物连接获得基因表达载体。
3.现需要构建同时含有mLDH、FDH的基因表达载体。
请你根据下图，提出将两个基因依次连入载体的思路___________（要体现选用的内切酶和连接的先后顺序）。
(4)还要注意转录方向。
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D
4.若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)
构建重组DNA(见图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是 ( )
巩固练习
1.从图1酶切结果分析，图2 中目的基因（长度为2.0kp）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（ ）

A、①， BamHⅠ B、①，EcoRⅠ和HindⅢ
C、②， EcoRⅠ D、②，EcoRⅠ和HindⅢ
1.3
4.5
2.3
3.5
B
2. 要在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中的质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙链为转录模板链。
①启动子往往具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择_______（填字母）。A．枯草芽孢杆菌启动子 B．乳酸杆菌启动子 C．农杆菌启动子②下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。
限制酶 EcoRI BamHI KpnI MfeI HindⅢ
识别序列及切割位点
为获得能正确表达W基因的重组质粒，应选用限制酶____________切割图1中的质粒，选用限制酶____________切割图2中含W基因的DNA片段。
B
MfeI、HindⅢ
EcoRI、HindⅢ

展开更多......

收起↑