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第2节 微生物的培养技术及应用
1
选择性必修3
第1章 发酵工程
1
课堂导入
经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，在经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是制作过程中有杂菌混入。
那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术
培养条件：
提供合适的营养和环境条件
确保其它微生物无法混入
培养基
无菌技术
微生物的基本培养技术（一）
一、
培养基的配制
概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质。
1. 培养基
作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
类型
（ ①提供微生物繁殖所需各种营养， ②异养微生物的能源）
固体
培养基
液体
培养基
有 无 琼脂
分离、
计数、
鉴定等
扩大培养
工业生产
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
标准 培养基种类 培养基特点 作用
物理性质 固体培养基 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
半固体 培养基 观察微生物的运动、分类鉴定
液体培养基 常用于工业生产
功能 选择培养基 选择 、分离
鉴别培养基 鉴定
成分来源 天然培养基 工业生产
合成培养基 分类鉴定
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
含化学成分不明确的天然物质
培养基成分明确
加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
选择培养基
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基中加氨苄青霉素
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
培养基原有菌落
2.培养基的配制
（1）营养成分：水、无机盐、碳源、氮源，此外还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的需求。
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
4. 培养基的营养构成:
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
碳源
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
氮源
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
无机盐
Ca、K 、Mg为大量元素
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素
凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。
（2）还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求
特殊营养物质：
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
(牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）
霉菌（pH调至酸性）
细菌（pH调至中性或微碱性）
厌氧生物（无氧条件）
乳酸菌（要添加维生素）
2.培养基的配制
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
二、
1. 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染
无菌技术
主要包括消毒和灭菌
消毒
对操作的空间、操作者的衣着和手
灭菌
培养细菌用的培养基与培养皿
玻棒、试管、烧瓶、吸管和接种环等
还要注意：
避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触
为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
2.消毒
是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
接种室、接种箱或超净工作台可用紫外线照射30min
100℃煮沸5-6 min
62-65℃下煮30 min或80-90℃处理30s-1min
用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；
氯气消毒水源等
煮沸消毒
巴氏消毒
化学药剂消毒
紫外线消毒
3.灭菌
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌。高压蒸汽灭菌效果最好，100 kPa、121℃下维持15-30 min，常用于培养基、无菌水等的灭菌。
160-170℃下加热2-3h。常用于玻璃器皿和金属器具。
常用于接种环、接种针、试管口等的灭菌。
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，工作台
（三）微生物的纯培养
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
（1）概念：
（2）内容：
1）配制培养基
2）灭菌（培养基和器具）
3）微生物接种
4）分离
5）恒温箱中培养
酵母菌的纯培养
探究-实践
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
1. 菌落：
2. 纯培养：
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
3. 原理：
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
方法步骤
1.制备培养基
1）配制培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml.
2）灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min.将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h.
包器材
倒平板的具体操作：
3）倒平板
待培养基冷却至50左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
1.拔出锥形瓶的棉塞
2.将瓶口迅速通过火焰
3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基到人，立即盖上皿盖。
4.等待培养皿冷却后，将培养皿倒过来放置。
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
问题讨论
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
问题讨论
2. 接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
(1)原理：
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
连续划线法
分区划线法
(2)“平板划线”实验操作
(2)“平板划线”实验操作
1. 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2. 在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞
3. 将试管口通过火焰
.4. 将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
5. 将试管通过火焰，并塞上棉塞
6. 左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
7. 灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
8. 将平板倒置放入培养箱中培养。
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
分区划线法
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
平板划线法注意事项:
（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
问题讨论
3.培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h.
结果分析与评价
1.未接种的培养基表面是否有菌落生长，如果有，说明了什么？
2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了菌落？这些菌落的颜色、形状、大小是否一致，如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析可能是哪些原因引起的吗？
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 .
自养型微生物
含碳有机物
下表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
固氮微生物
课堂巩固
答案：A
2.下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是(　　)
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板
D．待培养基冷却凝固后将平板倒过来放置
课堂巩固
答案：B
3. 下列关于灭菌和消毒的说法不正确的是(　　)
A．灭菌是指杀死环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子
B．灭菌和消毒实质上是相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等
课堂巩固
4.下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,据图分析不正确的是( )
A.获得图A效果的接种方法是稀释涂布平板法B.获得图
B效果的接种方法是平板划线法
C.若在纯化土壤细菌时菌液浓度过高,培养基上的菌落可能会连成一片
D.在接种前要对培养基进行消毒处理
答案：D
课堂巩固
5. 下列为几位同学描述的平板划线接种法的划线方式，其中正确的是（ ）
A.
B.
C.
D.
C
课堂巩固
课堂巩固
6. 养殖池中存在的有毒物质，主要是氨及亚硝酸，这两种物质可被硝化细菌吸收利用。在“养殖池底泥中硝化细菌的分离与计数”实验中，说法错误的是（ ）
A. 需要配制添加一定浓度氨盐的牛肉膏蛋白胨培养基，以筛选硝化细菌
B. 应对采集底泥使用的工具进行灭菌，全部接种过程均需在酒精灯火焰旁进行
C.可以采用平板划线法进行接种，还需与未接种的空白培养基同时培养
D.应将接种后的培养基放在光照培养箱中培养，原因是硝化细菌为生产者
ACD
酵母菌的纯培养
2.接种和分离酵母菌
课堂小结
1.制备培养基
3.培养酵母菌
①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）
②灭菌
③倒平板（在酒精灯火焰附近操作）
培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）
培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅）
用接种环在固体培养基上用平板划线法接种
平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养
课堂小结

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