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第3章 基因工程
　　指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
【归纳定义】工程别名：
操作对象：
操作水平：
工程实质：
什么是基因工程？
重组DNA技术
基因
DNA分子水平
基因重组
第1节
重组DNA技术的基本工具
从社会中来
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
三种“分子工具”
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
1’
2’
3’
4’
5’
G
限制酶
1’
2’
3’
4’
5’
A
磷酸二酯键
T
G
C
C
G
T
A
A
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
5'
3'
5'
3'
仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？
EcoRⅠ
……G-A-A-T-T-C……
……C-T-T-A-A-G……
HindⅢ
……A-A-G-C-T-T……
……T-T-C-G-A-A……
BamHⅠ
……G-G-A-T-C-C……
……C-C-T-A-G-G……
TaqⅠ
………T-C-G-A………
………A-G-C-T………
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
　
黏性末端　　　　
黏性末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
EcoRI 限制酶的切割：
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
来源：
种类：
主要来自原核生物
特点：
数千种
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。
旁栏思考
中轴线
SmaI 限制酶的作用：
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
在C和G之间切开
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
平末端　　　平末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
结果：
产生黏性末端或平末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？
（2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。
实践活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作
5’...TAG
3’...ATCTTAA
AATTCCA...3’
GGT...5’
AATTC ...... B t ...... G
G .....基因......CTTAA
黏性
末端
目的基因
黏性
末端
要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？
如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。
会产生相同的黏性(平)末端
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
思考
【反馈练习】
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
2.下列是由同种限制酶切割形成的DNA片段是（ ）
①…CTGCA …
G
②…G
…CTTAA
③ G…
ACGTC…
④ AATTC…
G…
A. ①③；②④ B. ①②；③④ C. ①④；②③ D.以上都不对
A
缺口怎么办？
一、限制性内切核酸酶 ——分子手术刀
什么样的末端才能连接起来？，
1. 作用：
2. 种类：
⑴ E·coli DNA连接酶
⑵ T4 DNA连接酶
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单个核苷酸
3、DNA连接酶的缝合作用
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
（1）E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
（2）T4 DNA连接酶连接平末端，效率低
3.E·coli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
类型 来源
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
功能
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸
二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
相同点
差别
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶的作用
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
4.几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
3.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
【反馈练习】
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
4.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(　　)
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
5.基因工程技术也称为重组DNA技术,下列有关基因工程的说法错误的是 (　　)
A.基因工程的基本原理是基因重组
B.基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
C.基因工程可以定向改造生物的性状
D.基因工程常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒
B
【反馈练习】
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
1.作用：
动植物病毒
噬菌体
2.种类：
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
大肠杆菌及质粒结构模式图
3、载体需具备的条件
（2）能够在受体细胞中复制并表达
（3）有某些标记基因
（4）对受体细胞无害.
或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
供外源DNA片段中的基因插入其中
便于鉴定和筛选
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
（1）有一个至多个限制酶切点
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
四基因工程意义：
6.下列有关质粒的叙述中,正确的是 (　　)
A.质粒是存在于细菌中的一种细胞器 B.质粒改造后可用作基因工程的载体
C.质粒上基因的表达不遵循中心法则 D.质粒必须具有抗生素抗性基因以便筛选
B
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
7．基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是（　 ）
A．能够复制，以便目的基因插入其中
B．具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选
D．对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选
C
8： 选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为________
2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为_________
①或②
①
*酶③也会切割酶②识别的序列，因此不能选择酶③
1.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的
DNA片段相连接 为什么
XbaI。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
课 堂 测 评
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
拓展： 1. 判断黏性末端是否为同一限制酶切割形成的方法
(1 ) 将黏性末端旋转 180° ，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。
(2) 两个末端若是由同一种限制酶切割产生的，则两个片段连接后还具有该种限制酶的识别序列和切割位点。
2. 同尾酶： 切割不同的 DNA 片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切核酸酶
这类酶的特点 :
①识别的序列不同 , 但可以切割出相同的黏性末端 , 且切割出的黏性末端可以相互配对。
②两个同尾酶切割的DNA片段连接后,一般情况下,原来的切割位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别。
DNA连接酶
用一种限制酶切（单酶切）
A
T
G
C
A
A
C
G
T
T
A
T
AGCTT
A
GGATCCA
CCTAGGTTCGA
Bt基因
用两种限制酶切（双酶切）
质粒与质粒连接后的运载体过大，导致转化难以发生，故不予考虑
避免自身环化，增大目的基因和运载体连接的概率，
能避免反向连接
DNA连接酶
基因工程的基本工具
2.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，________________________________________________________。
目的基因
质粒上的抗生素抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
【能力提升】
课 堂 测 评
（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。
目的基因与目的基因
质粒片段与质粒片段
反向连接
1、DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
（一）DNA粗提取的原理
2、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
---DNA的溶解性和耐受性
四、DNA的粗提取与鉴定
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
当NaCl的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大
先用2mol/L NaCl溶液溶解DNA，再加入蒸馏水，使其溶液
浓度从2mol/L下降到0.14 mol/L，使DNA在盐溶液中析出。
3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
①蛋白酶—水解蛋白质，对DNA没有影响。
②高温—大多数 在60～80℃时变性沉淀,而 在
80℃以上才会变性。
③洗涤剂—溶解细胞膜，
去除 ;
但对DNA没有影响。
蛋白质
DNA
脂质、蛋白质
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
材料用具
1.选材：
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
四、DNA的粗提取与鉴定
二苯胺试剂要现配现用，用棕色瓶保存。
DNA的粗提取与鉴定
试剂：
研磨液
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
《教材》P117——附录2
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
2.去除杂质——
3.DNA的析出——
1.破碎细胞——
洋葱
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
方法步骤
思考：如何评价结果？
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
析出DNA
四、DNA的粗提取与鉴定
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入
试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
4.DNA的鉴定——
二苯胺
2mol/L的NaCl
方法步骤
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
四、DNA的粗提取与鉴定
DNA的粗提取与鉴定
结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功； 如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法；对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果；如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等；看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
DNA的粗提取与鉴定
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。
例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液（体积比为24：1），通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
进一步探究
DNA的粗提取与鉴定
关键点拨
1．利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
2．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。
3．提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精
提纯效果更佳。
预冷的酒精具有以下优点：
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
3.一环状DNA分子,设其长度为1。限制性内切核酸酶A在其上的切点位于0.0处;限制性内切核酸酶B在其上的切点位于0.3处;限制性内切核酸酶C的切点未知。但C单独切或与A或B同时切的结果如下表,请确定C在该环形DNA分子的切点应位于图中的 (　 　)
A.0.2和0.4处 B.0.4和0.6处 C.0.5和0.7处 D.0.6和0.9处
A
C单切 长度为0.8和0.2的两个片段
C与A同时切 2个长度为0.2和1个0.6的片段
C与B同时切 2个长度为0.1和1个0.8的片段
课 堂 测 评
【能力提升】

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