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第二章 细胞工程
第3节 胚胎工程
二 胚胎工程技术及其应用
体外受精
早期
胚胎发育
是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，再经胚胎移植产生后代的技术。
受体母牛
(代孕)
精子
卵子
胚胎移植
受精卵
早期胚胎
试管牛
试管牛 = 克隆牛
到社会中去
试管动物技术：
核移植
体外受精
早期胚胎培养
胚胎移植
克隆牛
无性生殖
重组细胞
受精卵
试管牛
有性生殖
比较项目 试管动物(婴儿) 克隆动物
技术基础
生殖类型
后代性状 的继承特点
体外受精、胚胎早期培养
胚胎移植
动物细胞培养、动物体细胞核移植、胚胎移植
有性生殖
无性生殖
继承双亲的的特性
与核供体亲本基本一样
到社会中去
利用促性腺激素促使雌性动物排出更多的卵子，从输卵管中冲取卵子。
采集方法 适用范围 采集过程 培养
输卵管采卵 (冲取卵子)
卵巢 采卵 屠宰动物 的卵巢采卵
活体采卵
实验动物以及家畜
大型动物
或大家畜
小鼠、兔、猪、羊
牛、马
从已屠宰的雌性动物体内摘取卵巢，再从卵巢中采集卵母细胞
借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等仪器，直接从活体动物卵巢中吸取卵母细胞。
可直接与获能的精子在体外受精。
采集后的卵母细胞都要在体外经过人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。
(不需要)
(需要)
（1）卵母细胞的采集和培养
一、体外受精
（2）精子的获取
方法 操作过程 适用动物
培养法 将精子放入人工配制的获能液中使其获能 啮齿动物、家兔及猪等动物
化学 诱导法 将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导精子获能 牛、羊等家畜
精子在进行体外受精前需要精子获能处理
一、体外受精
对精子获能的理解:精子获能是获得受精的“能力”,而不是获得“能量”
精液由精子和精浆两部分组成。精浆中含有一种能抑制精子获能的物质，因此在一般情况下，精液中的精子无法获能。精子获能前进行离心处理，目的是除去精浆以利于精子获能。
一般情况下，可以将获能的精子和培养成熟的卵子置于获能溶液或专用的受精溶液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精。
一、体外受精
（3）受精----①过程
提高动物繁殖能力的有效措施
为胚胎移植提供可用的胚胎
一、体外受精
（3）受精----②意义
发展：我国的研究起步于20世纪80年代后期，目前已经在羊 、牛 、猪 和人等生物中取得成功。目前我国人和牛的体外受精技术已达到国际先进水平。
项目 自然受精 人工授精 体外受精
不 同 点 过程不同
场所不同
相同点
比较:自然受精、人工授精和体外受精的异同点
雌雄动物
交配完成
雌性动物
输卵管中
用人工的方法将公畜的精液注入母畜生殖道内，完成受精
人工获取精子、卵子，在体外培养液中完成受精过程
雌性动物
输卵管中
体外培养液中
①精子获能、卵子成熟后方能完成受精过程
②都是有性生殖
体外受精
早期
胚胎发育
受体母牛
(代孕)
精子
卵子
胚胎移植
受精卵
早期胚胎
试管牛
胚胎移植：是指将体外受精及其他方式（体内受精、转基因、核移植等）得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物的体内，继续发育为新个体的技术。
受体：接受胚胎的个体，承担繁重而漫长的妊娠和育仔任务
供体：提供胚胎的个体，产生具有优良遗传特性的胚胎。
早期胚胎
体外受精
体内受精
核移植
转入目的基因的受精卵
胚胎分割
有性
生殖
无性
生殖
胚胎移植
实质：早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。
地位：获得的胚胎都必须移植给受体才能获得后代。胚胎工程的最后技术环节。
二、胚胎移植
优良供体母牛
(遗传性状优良、生产能力强)
受体母牛
(有健康的体质和正常繁殖能力)
进行同期发情处理
1.什么是同期发情处理？
利用某些激素（一般用孕激素）人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。
二、胚胎移植
优良供体母牛
(遗传性状优良、生产能力强)
受体母牛
(有健康的体质和正常繁殖能力)
进行同期发情处理
2.同期发情处理的目的是什么？
使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致，供体的胚胎移入受体后有相同或相似的生存条件，这是胚胎移植成功与否的关键。
二、胚胎移植
优良供体母牛
(遗传性状优良、生产能力强)
对供体母牛进行超数排卵处理
3.超数排卵的目的是什么？
使一头母畜一次排出比自然情况下多许多的成熟卵子，用于配种或者人工授精，可获得多枚胚胎 ，经胚胎移植可得到多个后代。
4.如何进行超数排卵？
用外源促性腺激素处理供体母牛，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。
二、胚胎移植
优良公牛
优良供体母牛
(遗传性状优良、生产能力强)
促性腺激素超数排卵处理
发情配种或人工授精
收集胚胎并检查
正常繁殖或两三个月后进行另一次移植
受体母牛
(有健康的体质和正常繁殖能力)
进行同期发情处理
受体发情
移植胚胎
具有优良性状的后代
二、胚胎移植
移植后检查是否妊娠
发育到囊胚或桑葚胚
1、将检验合格的胚胎移植到任何一个受体的子宫内，胚胎都能正常发育吗 如果不能，在胚胎移植前应该对受体进行怎样的处理
不一定能正常发育。需要移植到同种的、生理状态相同的受体子宫内
思考讨论：
2、受体会不会对来自供体的胚胎发生免疫排斥反应
受体对来自供体的胚胎基本上不会发生免疫排斥反应。
在胚胎移植前要对受体进行同期发情处理，使供体和受体生殖器官的生理变化同步，这样才能为供体的胚胎移人受体提供相同的生理环境。
3.胚胎移植后，经受体孕育的后代，其遗传特性与供体还是受体保持一致 为什么
与供体保持一致。因为供体胚胎与受体子宫建立的仅是生理和组织上的联系。其遗传物质在孕育过程中不会发生任何变化。
4.胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。你认为这样的概括正确吗 为什么
正确。因为胚胎移植的成功率与供体、受体生理环境条件的一致性密切相关。只有供体、受体生理环境条件高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并能续发育。所以，我们可以把胚胎移植简单概括为早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。
移入胚胎一侧的受体子宫对应的卵巢必须有黄体存在
思考讨论：
遗传性状优良、生产能力强供体母牛
健康的体质、正常的繁殖能力受体母牛
多种激素同期发情处理
促性腺激素
超数排卵
供体公牛
发情配种或人工授精
收集胚胎并检查
胚胎移植
妊娠检查
分娩(胚胎移植的犊牛)
二、胚胎移植
3、意义
充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。
a.大大缩短了供体本身的繁殖周期。
b.增加供体一生繁殖后代的数量。
胚胎移植作为胚胎工程的最终技术环节，还将推动胚胎工程其他技术的研究和应用。
三、胚胎分割
胚胎分割技术的发展
1978年，科学家将小鼠的桑椹胚一分为二，获得了成功。
我国的胚胎工程专家也进行了分割胚胎移植的实验研究，成功地对小鼠、家兔、绵羊、山羊和牛等动物进行了分割胚胎移植，并将二分胚胎分割技术应用到牛和羊的胚胎移植中。
应用胚胎分割技术获得的三卵六羔羊
1979年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。
20世纪80年代后，人们建立了系统的胚胎分割法，并相继得到1/4和1/8分割胚胎后代。
体视显微镜
1.概念
：采用机械方法将早期胚胎切割成2等份，4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
理论依据
特点
早期胚胎细胞具有很强的分裂能力，并保持着细胞全能性。
后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可以看做动物无性繁殖或克隆的方法之一。
主要仪器设备
体视显微镜和显微操作仪
三、胚胎分割
桑葚胚或囊胚
繁殖方式：
无性繁殖（克隆）
工具：
分割针或分割刀
显微操作仪
2.操作程序
对囊胚阶段胚胎进行分割时一定要均分内细胞团。若分割不均，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题
选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，移入盛有操作液的培养皿中，在显微镜下切割。
分割后的胚胎可直接移植给受体，或经体外培养后，再移植给受体。
三、胚胎分割
做DNA分析
鉴定性别
思考：为什么要取滋养层细胞进行分析和鉴定？
①避免损伤内细胞团；
②滋养层和内细胞团均来自同一个受精卵的有丝分裂，含有相同的遗传物质。
三、胚胎分割
进行DNA分析的目的是进行遗传病筛查，以防止产生的后代具有严重的遗传病；进行性别鉴定，是为了人工筛选后代动物的性别。
三、胚胎分割
3.意义
a.提高胚胎利用率，促进优良动物品种的繁殖。
b.产生遗传性状相同的后代，作为遗传学研究的宝贵材料。
c.胚胎移植前，进行性别鉴定、遗传病筛查，对于人工控制动物性别，繁育健康动物后代具有重要意义。
4.局限性
①存在一些问题，如刚出生动物体重偏低，毛色、斑纹可能存在差异等。
四、胚胎分割
5.注意事项
1.胚胎分割份数不能过多。分割的次数越多，每一份的细胞数目越少，不但难以做到均等分割，而且囊胚期的内细胞团细胞所受的影响也越大。分割的份数越多，技术难度越大，移植后的和发育的难度越大，分割后胚胎成活的概率越小。
②实践证明，采用胚胎分割技术产生同卵多胎的可能性是有限的，分割次数越多，分割后胚胎成活的概率越小，目前仍然以二分胚胎的分割和移植效率最高。
2.同一胚胎经分割移植形成的后代具有相同的遗传物质，该过程中没有减数分裂、有性生殖细胞的形成、有性生殖细胞的结合属于无性繁殖或克隆。
可以向胚胎工程专家提出的问题有：公司繁育成功的良种奶牛是将胚胎几等分得到的后代 采用胚胎分割技术，理论上一头纯种荷斯坦奶牛一年可由代孕母牛生下多少头小牛 实际得到了多少头 如果理论值与实际值存在差异，产生差异的原因是什么 胚胎分割后经移植获得的同卵双胎或多胎，是否保持了良种奶牛所有的优良性状 是否有生理缺陷 等等。
从社会中来
荷斯坦奶牛的产奶量很高，某良种公司引进了纯种荷斯坦奶牛， 并用胚胎分割技术繁育了良种荷斯坦奶牛群体。如果你是一名科技专栏的记者，现在需要写一篇关于用胚胎分割技术繁育良种奶牛的报道，请写出你准备向胚胎工程专家提出的三个问题，然后与其它同学交换问题，再以访谈录的形式回答他提出的问题（可通过查阅网络、书籍上的资料或向专家请教等方式解决自己回答不出的问题）。
1. 体外受精和胚胎移植都是在医学和农业 生产上应用较多的胚胎工程技术。判断下列相关 表述是否正确。
(1) 采集来的卵母细胞和精子可以直接用于体外受精。（ ）
(2) 经胚胎移植产生的后代，苴遗传特性与受体保持一致。（ ）
(3) 进行胚胎移植前，要对供体和受体进行免疫检査，以防止发生免疫排斥反应。（ ）
×
×
×
练习与应用
雌性杜泊羊
雄性杜泊羊
卵母细胞
精子
采集
采集
受精卵
体外受精
早期胚胎
当地普通绵阳
杜泊羊
分娩
（ ）
（ ）
体外胚胎培养
胚胎移植
2.杜泊羊以其生长速度快、肉质好等优点，成为受广大消费者喜欢的绵羊品种。科研工作者通过胚胎工程快速繁殖杜泊羊的流程如下图所示。
练习与应用
（2）为了获得数量较多的卵母细胞，可以对雌性杜泊羊进行怎样的处理
可以对雌性杜泊羊进行超数排卵处理。
（3）在进行体外受精操作之前，还要对获得的卵母细胞和精子进行怎样的处
理
要对采集到的卵母细胞进行成熟培养，对采集到的精子进行获能处理。
2.杜泊羊以其生长速度快、肉质好等优点，成为受广大消费者喜欢的绵羊品种。科研工作者通过胚胎工程快速繁殖杜泊羊的流程如下图所示。
练习与应用
3.北方白犀牛曾经广泛分布于非洲中部等地, 但由于猖獗的盗猎和自然栖息地的丧失，它们的数量不断减少。2018年3月，世界上最后一头雄性北方白犀牛去世，该物种仅剩下两头雌性。在此之前，研究人员设法保存了北方白犀牛的精子。请回答下列问题。
(1) 我们可以使用哪些现代生物技术来人工繁育北方白犀牛？
运用这些技术一定能繁育成功吗？请说出你的理由。
可以使用人工授精、体外受精、胚胎移植、体细胞核移植等技术来人工繁育北方白犀牛。运用这些技术不一定能成功繁育北方白犀牛，因为任何一项技术都不能保证百分之百的成功率，何况现存的北方白犀牛数量极少。
练习与应用
(2) 如果繁育成功，这样人工繁育的种群与 野生种群相比，有什么区别？
这样人工繁育的种群与野生种群相比，遗传多样性会降低，野外生存能力也会下降。
(3) 如果繁育不成功，这一物种将永远从地 球上消失，从中我们能得到怎样的教训？
多种多样的生物是生态系统的重要成员，是一个个独特的基因库。任何一个物种的灭绝都可能产生多米诺效应，使其他相关物种受到影响，进而威胁到生态系统的平衡与稳定。保护濒危的野生动物，保护生物多样性刻不容缓。
练习与应用
1.若下图表示细胞工程操作中的某些过程，请回答下列问题。
A
B
C
复习与提高
(1) 如果A、B分别是白菜和甘蓝的原生质体，则C细胞再生出细胞壁后需要通过什么技术才能发育成杂种植株“白菜-甘蓝”？若白菜和甘蓝杂交产生了子代，该子代是否可育？为什么？
植物组织培养技术。白菜和甘蓝杂交产生的子代没有同源染色体，进行减数分裂时联会发生紊乱，不能形成正常的配子，所以该子代一般不可育。
1.若下图表示细胞工程操作中的某些过程，请回答下列问题。
A
B
C
(2) 若该图表示抗丙肝病毒的单克隆抗体制备过程中的一环，A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B细胞表示什么？符合要求的C细胞应具有哪些特点？
B淋巴细胞。能大量增殖并能产生抗丙肝病毒的抗体。
复习与提高
1.若下图表示细胞工程操作中的某些过程，请回答下列问题。
A
B
C
(3) 如果A、B分别是取自优良奶牛的卵细胞和精子，在进行体外受精时，一般要把A细胞培养到什么时期？B细胞则要经过什么处理才能与A细胞结合为受精卵？
减数分裂Ⅱ中期；获能处理。
复习与提高
2.2015年10月，我国科学家屠呦呦因发现青蒿素可以有效降低疟疾患者的死亡率而获得了诺贝尔生理学或医学奖。青蒿素类药物的市场需求很大，请你根据所学内容及以下信息，提出一条提高青蒿素类药物产量的研究思路。
（1）青蒿素的衍生物——双氢青蒿素也是很好的抗疟疾药物，并且它的药
物活性比青蒿素的高很多。
（2）青蒿素是从黄花蒿中提取的，在黄花蒿产生青蒿素的代谢过程中，某
些酶（如FPS酶）起决定性作用。
（3）野生黄花蒿在生长过程中，处于花蕾期时体内青蒿素含量最高。
（4）研究人员在对黄花蒿进行组织培养时，发现它的愈伤组织中没有青蒿
素，但是由愈伤组织再分化形成的芽和苗中均有青蒿素。
（5）四倍体黄花蒿体内青蒿素的含量比二倍体高38%，但四倍体植株比二
倍体植株矮小很多。
复习与提高
4.用秋水仙素处理黄花蒿种子或幼苗使之成为四倍体，获取青蒿素。或采用其他合理方法。
2.2015年10月，我国科学家屠呦呦因发现青蒿素可以有效降低疟疾患者的死亡率而获得了诺贝尔生理学或医学奖。青蒿素类药物的市场需求很大，请你根据所学内容及以下信息，提出一条提高青蒿素类药物产量的研究思路。
复习与提高
1.用基因工程技术将青蒿素基因或双氢青蒿素基因导入微生物，利用微生物合成青蒿素。
2.将FPS酶基因作为目的基因插入农杆菌T-DNA中，用农杆菌转化法导入青蒿素细胞，整合到青蒿素染色体DNA上，再利用植物组织培养获得FPS酶基因表达能力强、青蒿素产量高的品种。
3.用植物组织培养技术，将外植体脱分化形成愈伤组织，再诱导愈伤组织再分化成胚状体，获取青蒿素。
3.在章首页中介绍的体细胞克隆猴的培育过程中，我国科学家经过多年的反复实验，可以在10s之内对卵母细胞进行去核操作，在15s之内将体细胞注入去核的卵母细胞里。有评论者认为：该研究的研究者利用“聪明的化学方法和操作技巧”，攻克了多年来导致体细胞克隆猴失败的障碍。培育克隆猴的流程如下图所示，请结合图回答问题。
复习与提高
胎猴
取出
体细胞
用灭活的仙台病毒短暂处理
融合 培养
母猴
采集
卵母细胞
去核
去核卵母细胞
Kdm4d的mRNA
克隆小猴
生出
代孕母猴
胚胎移植
注入
重构胚
处理
TSA
（1）研究人员在将胎猴的体细胞注入去核的卵母细胞前，用灭活的仙台病毒进行了短暂处理。在此过程中，灭活的仙台病毒所起作用是什么？
诱导细胞融合
（2）为了调节相关基因的表达，提高胚胎的发育率和妊娠率，研究人员将组蛋白去甲基化酶Kdm4d的mRNA注入了重构胚，同时用组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA处理了它。这两种物质发挥作用的机制是什么？
这两种物质都是通过改变组蛋白的表观遗传修饰来调控基因表达。
组蛋白去甲基化酶Kdm4d的mRNA可以表达组蛋白去甲基化酶，该酶能降低组蛋白的去甲基化水平；
组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA可以抑制组蛋白脱乙酰酶的作用，提高组蛋白的乙酰化水平。
复习与提高
（3）评论者所说的培育过程中用到的“聪明的化学方法和操作技巧”，你认为具体体现在什么地方？
“聪明的化学方法”是指对重构胚的处理用了TSA以及将组蛋白去甲基化酶Kdm4d的mRNA注入了重构胚，这可以促进囊胚的发育和提高代孕母猴的妊娠率。
复习与提高
“操作技巧”是指科学家经过大量的训练，能在10s内完成对卵母细胞的去核操作，能在15s内将体细胞注入去核的卵母细胞，这样迅速的操作减少了对卵母细胞的损伤。
（4）你认为体细胞克隆猴的成功培育有什么意义？
在医学研究中通常需要用到遗传背景相似或相同的实验动物，这样实验组和对照组的比较才更具有说服力。小鼠因其能快速地进行近亲繁殖，产生大量遗传背景相似的后代，而被广泛用作实验动物。但是小鼠与人的亲缘关系太远，很多在小鼠体内有效的候选药物，用在人身上不一定有效，或有很大的副作用；在小鼠体内存在的致病机制也不一定存在于人体内。
由于猴与人的亲缘关系极近，培育大批具有相同遗传背景的克隆猴，对人类疾病致病机制的研究和新药的研发等具有重要意义。特别是在脑研究方面，克隆猴的培育将大大促进人类脑疾病的研究和治疗。例如，我们可以培育一批“模型猴”标记它们的某一类神经元，追踪其神经连接，由于这些猴的遗传背景一致，所以在研究中可以最大限度排除由基因差异造成的大脑结构形状不一的问题。克隆猴的成功培育标志着我国在非人灵长类疾病动物模型研究方面处于国际领先水平。
复习与提高

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